番茄酵素自然發(fā)酵過程中主要功效酶的變化

秦宇蒙，王艷麗，周笑犁, ，董平坤，吳棟斐

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005；2.貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州貴陽 550005）

微生物酵素是指含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、酶和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，一般以一種或多種新鮮水果、蔬菜、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而得，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力、保護心血管以及抑制肥胖等作用。由于發(fā)酵是一個復雜的微生物代謝過程，通過其自身的物質(zhì)代謝，使發(fā)酵原料在分子水平上發(fā)生分解和結構改變，產(chǎn)生了復雜的中間代謝或交叉代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)物質(zhì)之間的代謝轉化，從而產(chǎn)生新的生物活性成分，并代謝產(chǎn)生多種生物酶等。目前對于酵素的研究大多關于其發(fā)酵工藝的優(yōu)化，生物活性的探究，發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化以及代謝物質(zhì)的研究。如，以酵母菌和植物乳桿菌等菌株發(fā)酵棗汁或荔枝等果蔬汁，均發(fā)現(xiàn)發(fā)酵能影響其功效酶活性及其生物活性物質(zhì)；在蘋果酒發(fā)酵過程中，-葡萄糖苷酶、果膠酶和蛋白酶活性與其中酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)以及醛酮類物質(zhì)的含量具有很強的相關性，說明果蔬經(jīng)過微生物代謝酶催化碳水化合物等前體物質(zhì)的水解可以影響發(fā)酵產(chǎn)品的風味類型與強度。但對于果蔬自然發(fā)酵過程的代謝規(guī)律研究還較少，目前主要對蘋果、枇杷等果蔬自然發(fā)酵開展了生物活性物質(zhì)變化規(guī)律等研究，而對于果蔬自然發(fā)酵過程中功效酶變化規(guī)律的全面評價還鮮有報道。

本團隊前期對番茄酵素在自然發(fā)酵過程中的微生物區(qū)系和理化特性進行了探究，發(fā)現(xiàn)不同階段發(fā)酵液中均涵蓋了細菌和真菌兩大類，且以細菌占絕對優(yōu)勢，而細菌中優(yōu)勢菌主要包括乳桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏屬等；且隨著發(fā)酵時間的延長，活性物質(zhì)和抗氧化能力發(fā)生了顯著性變化。但是這些變化規(guī)律是否與發(fā)酵體系中的代謝酶的活性強弱具有一定的關聯(lián)性，因此，番茄酵素自然發(fā)酵過程中功效酶的動態(tài)變化亟待進一步探究。本研究以番茄自然發(fā)酵液為研究對象，分析其在發(fā)酵過程中淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的活力及其變化規(guī)律，以期為闡明番茄酵素功能活性機理和綜合開發(fā)利用提供相關理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮小番茄、白砂糖 購自沃爾瑪超市；三羥甲基氨基甲烷、三氯乙酸、TritonX-100、亞硫酸鈉、羥甲基纖維素鈉、果膠、沒食子酸 分析純，天津鼎盛鑫華化工有限公司；冰醋酸、三水合乙酸鈉、結晶酚、醋酸鈉、半乳糖醛酸 分析純，上海麥坤化工有限公司；碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、硼酸鈉、3，5-二硝基水楊酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯、氯化鈉、酒石酸鉀鈉分析純，天津市北辰方正試劑廠。

FA124 型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-3C pH 計 上海儀電科學儀器有限公司；UV-2550 型紫外可見光度計 濟南海能儀器股份有限公司；TCL-16A 型冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；AA605112 型恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 番茄發(fā)酵液的制備與取樣 將處理好的新鮮番茄與白砂糖按質(zhì)量比3:1 的比例放入滅菌發(fā)酵罐中，于室溫下避光固態(tài)發(fā)酵90 d，發(fā)酵前期每天上下翻轉搖晃玻璃瓶使白砂糖均勻融化，定期排氣防止脹罐，然后取0、10、20、30、60、90 d 的發(fā)酵液用于酶活力的測定。

1.2.2 酶提取液的制備 稱取適量樣品，研磨成勻漿后用磷酸鹽緩沖液稀釋，然后于4000 r/min 離心15 min，收集上清液，即為酶提取液。

1.2.3 淀粉酶活性的測定 參考陳爽等的方法。標準曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.6、1.0、1,4、1.8、2.0 mL 的1 mg/mL 麥芽糖標準液于試管中，加入蒸餾水使溶液體積至2 mL，最后向每支試管加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水至20 mL，在波長540 nm 處測吸光度值。以麥芽糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

淀粉酶活力的測定：試管A（對照）：1 mL 淀粉酶提取液（沸水浴，5 min）+1 mL 1%淀粉溶液（50 ℃，5 min）+2 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至20 mL；試管B（樣品）：1 mL 淀粉酶提取液+1 mL 1%淀粉溶液（50 ℃，5 min）+2 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至20 mL。每個樣品做三個平行，均于540 nm 處測吸光度值。

式中，m為反應體系中麥芽糖含量，mg；V為淀粉酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應時間，min；V為酶促反應時消耗的淀粉酶提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 纖維素酶活性的測定 參照QB 2583-2003纖維素酶制劑羧甲基纖維素-還原糖酶活力（CMCADNS）測定法。標準曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的1 mg/mL 葡萄糖標準液于試管中，加入蒸餾水使溶液體積至2 mL，最后向每支試管加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。將試管置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水至25 mL，在波長540 nm 處測吸光度值。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

纖維素酶活性的測定：試管A（對照）：0.5 mL 纖維素酶提取液（沸水浴，5 min）+1.5 mL 10 mg/mL CMC-Na（50 ℃水浴保溫30 min）+1.5 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至25 mL；試管B：0.5 mL纖維素酶提取液+1.5 mL 10 mg/mL CMC-Na（50 ℃水浴保溫30 min）+1.5 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至25 mL。每個樣品做三個平行，均于540 nm處測吸光度值。

式中，m為反應體系中葡萄糖含量，mg；V為纖維素酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應時間，min；V為酶促反應時消耗的纖維素酶提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 果膠酶活性的測定 參考Oliveira 等所報道的方法。標準曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2 mL 的1 μg/mL 半乳糖醛酸標準溶液于試管中，加入pH 為5.0 醋酸鹽緩沖液，使溶液體積至4 mL，最后向每支試管加入2 mL DNS 試劑。將試管置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加磷酸鹽緩沖液至20 mL，在波長540 nm 處測吸光度值。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

果膠酶活力的測定：取酶提取液0.2 mL，加0.5% pH 4.0 果膠溶液3.8 mL，37℃恒溫反應30 min后加入2.5 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，冷水浴至室溫后用緩沖液定容至25 mL。取10 mL 定容待測樣液于離心管中，10000 r/min 離心5 min，離心完后立即轉入預凍處理過的EP 管內(nèi)，放入盛放生物冰袋采樣箱內(nèi)于波長540 nm 測吸光值，每個樣品做三個平行。

式中，m為反應體系中半乳糖醛酸含量，μg；V為果膠酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應時間，min；V為酶促反應時消耗的果膠酶提取液體積mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 脂肪酶活性的測定 對硝基苯酚標準曲線的繪制：將對硝基苯酚標準溶液用無水乙醇溶液稀釋成適當?shù)奶荻?，加? mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸混合，再加入15 mL 0.5 mol/L NaOH 調(diào)pH，直至pH 與加酸前一致，分別測定吸光度。

脂肪酶活力的測定：取4 mL p-NPP 底物溶液，37 ℃預熱5 min 后加入1 mL 脂肪酶提取液，反應10 min 后立即加入5 mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸混合均勻，放置5 min 終止反應，再加入15 mL 0.5 mol/L NaOH 調(diào)pH，直至pH 與反應前一致，用1 mL 蒸餾水替換作為對照，于410 nm 測定吸光度。

式中，C 由標曲查得的對硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿度調(diào)節(jié)后的反應液總體積mL；V為樣品處理液總體積，mL；T 為酶促反應時間，min；V為酶促反應時消耗的脂肪酶提取液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 蛋白酶活性的測定 參照GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中的福林法進行測定。標準曲線的制作：分別配制0、10、20、30、40、50 μg/mL L-酪氨酸標準溶液，分別吸取上述溶液1 mL，加入5 mL 碳酸鈉和1 mL 福林酚試劑，振蕩均勻，置于37 ℃水浴中顯色20 min，以蒸餾水代替酪氨酸作為空白對照，用分光光度計在波長680 nm 下測定其吸光度。以酪氨酸的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

蛋白酶活性的測定：取1 mL 蛋白酶提取液，加入酪蛋白溶液1 mL 搖勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min 后，加入2 mL 三氯乙酸，搖勻靜止10 min后過濾，取1mL 濾液加碳酸鈉溶液5 mL 和1 mL 福林酚試劑，在37 ℃水浴中顯色20 min，用1 mL 蒸餾水替換酶提取液作為空白對照，在波長680 nm 處測定吸光度。

1.2.8 超氧化物歧化酶活性的測定 在堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化，可根據(jù)SOD 抑制鄰苯三酚自氧化能力測定SOD 酶活力，具體測量方法參照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性》。

鄰苯三酚自氧化速率的測定：在試管中加入2.35 mL Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL 蒸餾水和0.7 mL 鄰苯三酚溶液，然后渦旋處理3 s，立即將混合液在325 nm 波長條件下讀取30 s 吸光值。

樣品抑制鄰苯三酚自氧化速率測定：冰浴保存的樣品放入25 ℃水浴鍋中水浴3 min 后避光保存。以鄰苯三酚自氧化速率實驗為參比，于25 ℃環(huán)境中，向離心管中加入2.35 mL Tris-HCl 緩沖液，0.1 mL 酶提取液，0.7 mL 鄰苯三酚溶液，渦旋處理3 s。立即將混合液在325 nm 波長條件下讀取吸光值。

式中：△A為鄰苯三酚自氧化速率；△A′為SOD 酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；4.5 為反應液總體積mL；V為所加樣液體積，mL；V為樣液總體積，mL；n 為樣液的稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3 統(tǒng)計分析

每組試驗重復3 次，結果以平均值±標準差（X±SD）表示，試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）和SPSS 25.0 軟件進行單次實驗統(tǒng)計檢驗數(shù)據(jù)性狀分析，采用Duncan 多重極差法進行統(tǒng)計檢驗，確定各試驗數(shù)據(jù)性狀的顯著性（＜0.05），采用Excel 2016 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 番茄酵素自然發(fā)酵過程中淀粉酶活力的變化

由圖1 可知，番茄酵素在發(fā)酵0～30 d 時其淀粉酶活力變化較小，隨后其活力顯著上升（＜0.05），在發(fā)酵第90 d 時酶活達到了79.289 U/g。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中過高的可溶性固形物含量具有較高的滲透壓，對微生物活力具有一定的抑制作用，從而影響代謝酶的積累。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，番茄酵素發(fā)酵過程中可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低，這可能有助于淀粉酶的產(chǎn)生。并且番茄酵素在發(fā)酵后期，酵母菌逐步成為了真菌中的優(yōu)勢菌，它在分解多糖時需要在細胞水平將碳水化合物分解為雙糖，才能被轉移到細胞內(nèi)部，并在細胞內(nèi)部進一步降解為單糖，在這一過程中酵母菌是通過在環(huán)境中分泌生物胞外酶來實現(xiàn)代謝的。因此，在番茄發(fā)酵后期淀粉酶活力驟然升高。

圖1 淀粉酶活力變化Fig.1 Change of amylase activity

2.2 番茄酵素自然發(fā)酵過程中纖維素酶活力的變化

由圖2 可知，在番茄酵素自然發(fā)酵的過程中，纖維素酶活力逐漸上升（＜0.05），并于發(fā)酵第90 d 達到38.180 U/g。其變化趨勢與淀粉酶的變化趨勢相近，可能是由于在發(fā)酵中后期，發(fā)酵體系中的碳源不足以維持菌種的生命活動，促使產(chǎn)酶微生物代謝產(chǎn)生了糖類水解酶，使得纖維素酶得以快速累積。并且前期研究也發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生纖維素酶的曲霉屬相對豐度也有所增加，這與纖維素酶活力的遞增形成相互佐證。

圖2 纖維素酶活力變化Fig.2 Change of cellulase activity

2.3 番茄酵素自然發(fā)酵過程中果膠酶活力的變化

果膠酶作為一類分解果膠質(zhì)的酶，它可以協(xié)同纖維素酶破壞植物的細胞壁，促進有效成分的溶出。由圖3 可知，果膠酶活力在番茄酵素自然發(fā)酵的不同階段存在顯著性差異（＜0.05），隨著發(fā)酵時間的延長，酶活呈先上升后下降的趨勢，且均高于發(fā)酵前（＜0.05），并于20 d 達到了最大值（3.733 U/g）。本團隊在前期研究發(fā)現(xiàn)，能夠產(chǎn)生果膠酶的青霉屬與假單胞菌屬為發(fā)酵前的優(yōu)勢菌屬，其在適宜的環(huán)境大量產(chǎn)生果膠酶，使得果膠酶在發(fā)酵前期具有較高的酶活力。而隨著發(fā)酵進行，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生改變，微生物之間存在競爭關系，使其產(chǎn)果膠酶相關微生物的數(shù)量減少，且在發(fā)酵過程中，隨著體系pH 逐漸降低，通過引起細胞膜電荷的變化，從而影響著微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使得代謝過程中酶活發(fā)生了改變，因此在發(fā)酵30 d 后體系中果膠酶活力出現(xiàn)了降低的現(xiàn)象。微生物在生長發(fā)育過程中會不斷向外分泌胞外酶，用以分解外界復雜的有機物，從而獲取有機營養(yǎng)物質(zhì)。其中較重要的是與多糖降解相關的酶，如淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等。本研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶、纖維素酶和果膠酶活力都較發(fā)酵前高，因此酵素體系中的微生物可以很好的將大分子糖類進行水解，而某些微生物可以利用低分子糖類生成醇和酸，從而使得體系的酒精度和pH 發(fā)生變化。

圖3 果膠酶酶活力變化Fig.3 Change of pectinase activity

2.4 番茄酵素自然發(fā)酵過程中脂肪酶活力的變化

番茄自然發(fā)酵過程中脂肪酶活性變化如圖4 所示。番茄酵素自然發(fā)酵過程中脂肪酶活力最大值為0.856 U/g，活力較其他酶活低，該結果與蘋果酵素、水果酵素等一致。這可能因為這些酵素的發(fā)酵原料為脂肪含量較少的果蔬，以至于微生物代謝產(chǎn)生的脂肪酶較少。番茄酵素發(fā)酵過程中脂肪酶活力在0～60 d 呈現(xiàn)較平穩(wěn)的上升趨勢，并在第60 d 取得最大值，其原因可能是發(fā)酵過程中番茄酵素的發(fā)酵體系適宜產(chǎn)脂肪酶微生物進行生長代謝，使得發(fā)酵后的脂肪酶活力提高。然而隨著發(fā)酵進行到90 d 時，其活性顯著下降（＜0.05）。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)番茄酵素在發(fā)酵過程中乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢菌種，使得體系pH 下降至3.3，整體呈酸性，而脂肪酶的最適pH 在中性或堿性范圍內(nèi)。因此，在發(fā)酵后期，其活性顯著降低。

圖4 脂肪酶活力變化Fig.4 Change of lipase activity

2.5 番茄酵素自然發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化

蛋白酶是一類具有復雜結構并能夠催化蛋白質(zhì)水解生成多肽及小分子氨基酸的酶，來源廣泛，在動植物細胞及微生物的新陳代謝和調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。由圖5 可知，番茄酵素自然發(fā)酵過程中蛋白酶活力變化規(guī)律較為復雜，在發(fā)酵0～60 d 時呈波動變化，在發(fā)酵90 d 時其活力驟然上升至45.6 U/g（＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酵素自然發(fā)酵過程中蛋白酶活力隨著發(fā)酵時間的延長呈逐漸升高趨勢，并于發(fā)酵60 d 后趨于穩(wěn)定，香蕉酵素自然發(fā)酵過程中蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢，由此可知酵素采用不同原料進行發(fā)酵時蛋白酶活力的變化規(guī)律存在一定差異。番茄酵素在發(fā)酵前期呈波動變化，可能原因是0～60 d 酵素中產(chǎn)生蛋白酶的微生物和其他菌種之間存在競爭關系，并且發(fā)酵前期菌種不斷產(chǎn)酸，pH 的下降對蛋白酶活性存在影響，但在60 d 之后，體系逐漸形成了優(yōu)勢菌種且環(huán)境趨于穩(wěn)定，使得蛋白酶活力迅速增加。

圖5 蛋白酶活力變化Fig.5 Change of protease activity

2.6 番茄酵素自然發(fā)酵過程中超氧化物歧化酶活力的變化

番茄酵素不同發(fā)酵階段的SOD 酶活力變化規(guī)律如圖6 所示。SOD 酶活力在0～20 d 時呈現(xiàn)顯著上升趨勢（＜0.05），隨后變化緩慢，在發(fā)酵60 d 時趨于最大。賈麗麗等發(fā)現(xiàn)，SOD 酶活力與生物量變化之間呈現(xiàn)顯著正相關。由此推測，隨著發(fā)酵的進行，微生物增加，有利于SOD 酶的產(chǎn)生。但是在發(fā)酵后期，發(fā)酵產(chǎn)物和菌種之間存在競爭或者菌種可利用的營養(yǎng)物質(zhì)變化趨于穩(wěn)定，使得SOD 酶活力也漸漸趨于穩(wěn)定。由于SOD 酶具有清除自由基和過氧化氫等抗氧化能力，是細胞防御系統(tǒng)中的主要抗氧化酶?；诒緢F隊前期對番茄酵素抗氧化能力變化的分析，將本實驗中測定的SOD 酶活力變化規(guī)律與抗氧化指標進行了相關性分析（表1），發(fā)現(xiàn)SOD 酶活力與ABTS自由基清除率、DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關（＜0.01）。這表明，發(fā)酵體系中具有能夠產(chǎn)生SOD 酶的微生物，從而可以增加發(fā)酵體系的抗氧化活性，并且SOD 也是番茄酵素抗氧化活性功效酶的來源之一。而SOD 與還原力之間無顯著相關性（＞0.05），這可能是由于番茄酵素中的SOD 不是主要參與體系的還原能力，并且也說明對番茄自然發(fā)酵酵素功效物質(zhì)與抗氧化能力之間的全面評價需多種測定方法體系和多種活性物質(zhì)共同進行，這有待于進一步研究。

表1 SOD 酶活力與抗氧化活性指標的相關性分析Table 1 Correlation analysis between SOD enzyme activity and antioxidant activity index

圖6 超氧化物歧化酶活力變化Fig.6 Change of superoxide dismutase activity

3 結論

本文通過對番茄酵素自然發(fā)酵過程中淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶的變化進行了研究。結果表明，隨著番茄酵素自然發(fā)酵時間的延長，淀粉酶和纖維素酶活力逐漸增加，發(fā)酵結束時，其酶活分別為79.289、38.180 U/g；而果膠酶、脂肪酶整體呈先上升后下降的趨勢，分別于發(fā)酵20、60 d 達最大酶活力；蛋白酶活力則在發(fā)酵前期呈波動變化，隨后顯著上升；表明自然發(fā)酵后的番茄酵素，體系中功效酶的活性均有著明顯變化。另外，SOD 酶活力呈先迅速上升后趨于平緩，于60 d達到了最大值；并與ABTS自由基清除率、DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關（＜0.01），這為番茄酵素抗氧化能力的主要功效物質(zhì)探究奠定了基礎。綜上所述，發(fā)酵不僅可以提高酵素的酶活性，還能促進體系中物質(zhì)轉換和活性物質(zhì)生成，從而提升酵素的品質(zhì)；研究結果可為番茄酵素的發(fā)酵機理以及產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供一定的理論指導。