辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯的制備工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)分析

孫夢雯，莫曉峰，陳 櫻，王亞娟, ，仇 丹,

（1.寧波工程學院材料與化學工程學院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022）

淀粉是食品中主要的能量供應物質(zhì)，也是極其重要的工業(yè)原料。天然淀粉往往通過改性來獲得一系列用于各種用途的功能特性，如溶解性、耐熱性、乳化性等。自從Caldwell 等首次申請淀粉與二羧酸酸酐反應的專利以來，國內(nèi)外的學者就開始了辛烯基琥珀酸淀粉酯（OSS）的相關(guān)研究。OSS 因具有更高的粘度、更好的糊狀透明度、凍融穩(wěn)定性和優(yōu)異的乳化性能，已廣泛被應用于肉制品、飲料、制藥和微膠囊等領域。

芋頭是一類具有保健價值的根莖類食物，主要產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，被認為是世界上第五大根作物。芋頭中淀粉含量豐富，約占干基重的70%～80%；芋頭淀粉顆粒小，粒徑只有1～5 μm，淀粉粒徑越小，經(jīng)辛烯基琥珀酸酐（OSA）酯化后的乳化性越強，穩(wěn)定油滴的能力也更強。另外，芋頭淀粉中直鏈淀粉含量低，膨脹性強，因此被廣泛應用在食品和制藥工業(yè)。然而，芋頭產(chǎn)地是影響其中淀粉性能的因素之一。奉化芋頭為國家地理標志產(chǎn)品，長期以來備受矚目，項目組之前的研究表明，奉化芋頭淀粉的顆粒較其他品種及產(chǎn)地的小，大部分介于0.5～2 μm，且其中快消化淀粉質(zhì)量分數(shù)較高，可達71.1%，而同為浙江產(chǎn)地的溫嶺芋頭快消化淀粉的質(zhì)量分數(shù)僅為64.8%。

目前關(guān)于芋頭淀粉的研究多集中在其提取、理化性質(zhì)等方面，而其OSA 酯化工藝的研究相對較少。由于奉化芋頭淀粉中較低的直鏈淀粉含量、極小的粒徑及微觀結(jié)構(gòu)有別于常規(guī)芋頭淀粉，因此其辛烯基琥珀酸酯的反應工藝及理化性質(zhì)有待進一步深入研究。此外，現(xiàn)有關(guān)于辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS）的研究，均以滴定法測定取代度（degree of substitution，DS），而該方法忽略了淀粉酯中游離的辛烯基琥珀酸的含量，從而降低了結(jié)果的準確性。

奉化芋頭作為當?shù)氐囊环N豐富的經(jīng)濟作物，研究奉化芋頭淀粉的辛烯基琥珀酸酯化工藝，有利于促進其在食品、醫(yī)藥等領域的應用。因此，本研究以奉化芋頭為原料，采用水磨堿提法提取其中的淀粉，以OSA 為酯化劑制備辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS），使用高效液相法為檢測手段，以芋頭淀粉酯的DS 為響應值，通過單因素實驗確定所選因素的影響規(guī)律，然后采用響應面法優(yōu)化最佳酯化工藝。最后，對比了奉化芋頭淀粉及其酯化產(chǎn)物的部分理化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奉化芋頭 寧波當?shù)夭耸袌?；辛烯基琥珀酸酐（OSA） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲亞砜DMSO 色譜純，霍尼韋爾有限公司；乙腈 色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；三氟乙酸 色譜純，南京國晨化工有限公司；其他化學試劑 均為分析純。

Agilent 1260 高效液相色譜儀、ZORBAX-SBC（5 μm，4.6×150 mm）色譜柱 安捷倫科技有限公司；D8 AdvanceX 射線衍射儀 德國Bruker；S4800掃描電鏡 日本日立公司；OAC 15 水接觸角測試儀德國Dataphysics 儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芋頭淀粉（TS）提取工藝實驗方法 參考Jiang等并稍作修改。具體操作如下：芋頭洗凈去皮切塊，置于燒杯中，于4 ℃冰箱中用2.5 g/L 的氫氧化鈉溶液浸泡12 h。使用攪拌機打漿，依次過篩3 次（網(wǎng)篩為70、270、400 目），收集濾液靜置沉淀后，于3000 r/min 下離心10 min。去除液體及沉淀上層黃色的蛋白質(zhì)，加入蒸餾水，攪拌形成懸濁液，再次于3000 r/min 下離心10 min，重復此步驟到上層無黃色蛋白層為止，用0.1 mol/L HCl 調(diào)至中性，再重復離心步驟3 次。將沉淀放入40 ℃烘箱中烘烤48 h，烘干后用研缽磨成粉，過70 目篩，裝袋備用。

1.2.2 辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS）制備工藝實驗方法 參考Bai 等并做適量修改。稱取4.0 g芋頭淀粉于四口燒瓶中，加適量的水配制成一定濃度的淀粉乳液，攪拌10 min 后用3% NaOH 溶液調(diào)節(jié)淀粉乳pH 至一定值，繼續(xù)攪拌20 min，使用滴液漏斗將淀粉干基質(zhì)量3%的辛烯基琥珀酸酐（OSA）（使用5 倍的無水乙醇稀釋）逐滴滴加到淀粉乳中，特定溫度下反應一定時間，期間使用自動電位滴定儀檢測反應pH，使之維持在特定值，而后使用0.1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 至6.0。將混合物過濾，使用去離子水及無水乙醇，各洗滌3 次，然后凍干得到OSTS。

1.2.3 單因素實驗 參照徐瓊等關(guān)于馬鈴薯淀粉酯化的條件，以取代度DS 為響應值，依次考察淀粉乳濃度、反應pH、反應溫度及反應時間對DS 的影響。固定淀粉乳濃度35%、pH8.5、反應溫度35 ℃、時間3 h 中的三個因素水平值，對第四個因素進行單因素實驗。實驗因素條件為反應溫度20、30、40、50 ℃，反應時間1、2、3、4 h，淀粉乳濃度30%、35%、40%、45%，反應pH 為7.5、8.0、8.5、9.0。

1.2.4 響應面試驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上明確芋頭淀粉的最佳提取因素范圍，采用Box-Behnken試驗設計原理設計響應面，其因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 高效液相色譜法測定OSTS 的取代度 使用本課題組之前的高效液相方法測定。液相色譜參數(shù)：Agilent1260 高效液相色譜（HPLC），色譜柱為ZORBAX-SB-C柱；流動相：乙腈和水（0.1% 三氟乙酸（TFA））的混合物（45:55，v/v）；檢測波長為200 nm；流速1 mL/min；檢測溫度為30 ℃；進樣量20 μL。

總OS 含量測定：取0.5000 g OSTS（干重），加入20 mL 4 mol/L 氫氧化鈉，攪拌過夜，取4 mL 堿液到50 mL 容量瓶中，加入20 mL 1 mol/L 鹽酸，用乙醇定容，過濾后用HPLC 檢測。

游離OS 含量測定：取0.2500 g OSTS 樣品（干重），加入10 mL 甲醇，磁力攪拌1 h，然后4000 r/min離心10 min，取上清液1 mL 于取樣瓶，與1 mL 水（預先調(diào)到pH3）混合，過濾后進行HPLC 分析。

游離OS（%OS），總OS（%OS），取代OS（%OS），計算公式如下：

式中：W和W分別是游離的OSA 和總的OSA 的質(zhì)量，代入標準曲線Y=0.0009x-0.3848計算（其中Y 為OSA 含量，μg；x 為峰面積）；W 為檢測的OS 淀粉的質(zhì)量；210 和162 分別是OSA 和葡萄糖單元的分子量；1000 和12500 分別是稀釋倍數(shù)。

1.2.6 X-射線衍射分析（XRD） 取適量樣品平鋪于樣品盤的凹槽中，將樣品表面平整使其與樣品盤外表面相平，而后將樣品盤置于儀器中，測試波長為1.5 ?的單色Cu-Ka 射線，測試條件為管壓50 kV、管流27 mA，掃描區(qū)域為5°～60°。

1.2.7 掃描電鏡分析（SEM） 芋頭淀粉酯化前后的顆粒形態(tài)使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行觀測：取微量淀粉粉末樣品，使用導電膠將其均勻分散于載物臺上，洗耳球吹去未粘牢的樣品。該樣品臺置于離子濺射噴鍍儀中鍍金，處理好后的樣品放入掃描電鏡樣品室觀察并拍照。

1.2.8 接觸角的測定測試方法 參照Chi 等，并做適量修改。稱取0.05 g 樣品加入5 mL 二甲亞砜DMSO，75 ℃水浴中攪拌使之完全溶解。然后滴管滴到玻片上，在80 ℃烘箱中干燥2 h 后，測接觸角。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)均為三次實驗的平均值±標準差。使用軟件Design-Expert（Version 10.0.5，State-Ease Inc.,Minneapolis,Minnesota,USA）對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 溫度對OSTS 取代度的影響 酯化反應溫度對OSTS 的取代度影響見圖1。由圖1 可看出，溫度從20 到40 ℃，DS 逐漸增加，溫度上升到50 ℃時DS 下降。主要原因是酯化反應為吸熱反應，溫度較低時，不利于酯化反應的發(fā)生，隨著溫度的升高，OSA 在溶液中的擴散增強，其與淀粉分子的接觸及反應效率均會提高，但溫度過高時，OSA 易發(fā)生水解，不利于反應的進行。因此反應溫度優(yōu)選40 ℃。

圖1 溫度對OSTS 取代度的影響Fig.1 Effect of the temperature on the degree of substitution of OSTS

2.1.2 時間對OSTS 取代度的影響 酯化反應時間對OSTS 的取代度影響見圖2。圖2 結(jié)果顯示，隨著反應時間延長，DS 也呈先增大后減小的趨勢，這是因為OSA 在水相體系中除了發(fā)生酯化反應外，也會發(fā)生自身水解反應。3 h 后，可能是OSA 被消耗掉，因此不再發(fā)生酯化反應。在Lan 等關(guān)于美人蕉淀粉的OSA 酯化研究中也觀察到類似的結(jié)果。

圖2 時間對OSTS 取代度的影響Fig.2 Effect of the time on the degree of substitution of OSTS

2.1.3 淀粉乳濃度對OSTS 取代度的影響 圖3 為不同淀粉乳濃度時制備的OSTS 中的取代度，由圖3可知，隨著淀粉濃度的增加，DS 呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這是由于淀粉濃度的增加提高了反應體系中OSA 與淀粉顆粒接觸及反應的概率，使酯化反應朝著有利的方向進行。當TS 濃度高于40%時，淀粉濃度的增加使得溶液粘度高，限制了淀粉的非晶態(tài)區(qū)與OSA 的接觸。

圖3 淀粉乳濃度對OSTS 取代度的影響Fig.3 Effect of the starch concentration on the degree of substitution of OSTS

2.1.4 pH 對OSTS 取代度的影響 由圖4 可知，隨著pH 的增大，取代度也先增大后減小，當溶液pH為8.0 時，DS 達到最大值，當pH 進一步增加到8.5時，DS 下降，說明高pH 對酯化反應有一定的不利影響。此外，淀粉與OSA 的酯化反應是可逆親核取代反應，pH 大于8 時，OSA 偏向水解趨勢，當pH 小于8 時，溶液的堿性不能有效激活淀粉中羥基的反應活性，即不能形成親核基團，取代度較低。

圖4 反應pH 對OSTS 取代度的影響Fig.4 Effect of pH value on the degree of substitution of OSTS

2.2 響應面試驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，選擇pH（A）、時間（B）、溫度（C）和淀粉濃度（D）四個因素為自變量，相應OSTS 的DS 為響應值（Y），采用響應面方法探究芋頭淀粉在不同條件下的取代度，試驗方案及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2 中的結(jié)果，采用Design-Expert 10.0 分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸，得到取代度（Y）與pH（A）、時間（B）、溫度（C）和淀粉濃度（D）之間的二次多元回歸方程為：

表2 Box-Behnken 試驗設計結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

通過軟件對上述結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

決定系數(shù)R表示方程的擬合性，R越接近1，表明該方程擬合的越好。由表3 可知，R=0.9871，說明該模型可以解釋98.71%的實驗數(shù)據(jù)，即影響DS 的因素98.71%來自淀粉濃度、pH、反應時間和反應溫度這四個因素。模型的=76.24，＜0.0001，極顯著，說明模型良好可用。經(jīng)過方差分析，四個因素對DS 的影響的主次順序是：D＞A＞C＞B，即淀粉乳濃度的影響最大，其次是反應的pH，再次為反應時間，其中反應溫度對取代度的影響不明顯。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 10.0 軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到芋頭淀粉酯化的最佳工藝條件為：反應pH8.26、反應時間2.51 h、溫度40.97 ℃、淀粉乳濃度38.68%，此時OSTS 的取代度為0.02072。為了驗證模型的有效性，考慮到實際情況將最佳提取條件定為：反應pH8.5、反應時間2.5 h、溫度41℃、淀粉乳濃度40%，在此工藝下，OSTS 的DS 為0.02069，此時的取代效率為68.97%，而Yu 等使用萊陽芋頭淀粉做OSA 酯化時，當OSA 用量為3%時，其DS 為0.018，相應的取代效率為60%，低于采用本實驗所確定的最優(yōu)條件制備的產(chǎn)物。本實驗所得DS與預測值的相對誤差為0.14%，兩者相比無顯著差異，說明該模型合理。

2.3 淀粉酯化前后性質(zhì)

2.3.1 XRD 分析 圖5 為芋頭淀粉酯化前后的XRD圖，其中數(shù)字表示樣品的相對結(jié)晶度。從圖5 可以看出，奉化芋頭淀粉的晶型為典型的A 型結(jié)晶，即其單峰出現(xiàn)在衍射角2為15°和24°左右，雙峰出現(xiàn)在17°～19°左右。而樣品OSTS 的衍射峰位并未發(fā)生明顯偏移，即證明酯化并沒有改變芋頭淀粉的晶型，與Song 等關(guān)于大米、藜麥淀粉的酯化結(jié)果相似，即淀粉顆粒的酯化不會改變其原有的晶型。Liu 等研究發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒有層狀結(jié)構(gòu)，即生長環(huán)，表層向內(nèi)為結(jié)晶區(qū)-非結(jié)晶區(qū)-結(jié)晶區(qū)-非晶區(qū)交替存在。而在酯化反應時，少量的OSA 可滲透到結(jié)晶區(qū)，因此導致經(jīng)酯化后淀粉結(jié)晶度的降低，如本實驗中芋頭淀粉的相對結(jié)晶度為19.04%，酯化后降至15.20%。這與Bajaj 等的結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)高DS 的OSA 酯化蕓豆淀粉相對結(jié)晶度從38.3%降為18.74%，原因是OSA 反應過程破壞了淀粉的晶體結(jié)構(gòu)。

圖5 芋頭淀粉及其酯化淀粉XRD 圖Fig.5 XRD patterns of TS and OSTS

2.3.2 微觀形貌分析 芋頭淀粉酯化前后的掃描電鏡圖見圖6，A 為原芋頭淀粉，B 為酯化芋頭淀粉。比較該圖可發(fā)現(xiàn)，芋頭淀粉的粒徑較?。?.5～4 μm），存在團簇現(xiàn)象，顆粒較光滑但向內(nèi)凹。酯化后的OSTS 仍有團聚體，向內(nèi)凹程度更明顯，顆粒表面粗糙程度增加。這與Yu 等研究相似，即酯化過程中NaOH 對淀粉顆粒表面有一定的腐蝕作用。在酯化反應過程中，OSA 與淀粉顆粒接觸，主要與非結(jié)晶區(qū)反應，使OSA 分布在每一層的非結(jié)晶區(qū)、通道、顆粒中心空腔中。

圖6 芋頭淀粉酯化前后不同放大倍率的電鏡圖Fig.6 SEM images of TS and OSTS with different magnification

2.3.3 接觸角分析 接觸角θ 可以體現(xiàn)樣品的親水程度，θ 越大代表顆粒疏水性越好。圖7 列出了芋頭淀粉酯化前后的水接觸角，由圖可發(fā)現(xiàn)TS 為86.2°，與Shao 等測的82°相近；而OSTS 的接觸角為120.9°，這與Yu 等的結(jié)論相符，芋頭淀粉經(jīng)OSA酯化后其水接觸角由25.4°增加到70.1°。的具體值相差較大的原因是測試方法的不同，Yu 等均是直接將淀粉壓片，淀粉的結(jié)構(gòu)相對完整，測定的是其表面的疏水性，而本實驗中是先將淀粉溶于DMSO中后干燥成膜，在溶解的過程中淀粉的鏈狀分子結(jié)構(gòu)會舒展開，原本在其內(nèi)部的疏水性基團更多的暴露出來，使得其水接觸角更大，但是酯化前后變化趨勢相似，即隨著OSA 與淀粉反應的發(fā)生，淀粉分子中部分羥基被取代，疏水性增強，接觸角變大。

圖7 芋頭淀粉及其酯化淀粉接觸角Fig.7 Contact angle of TS and OSTS

3 結(jié)論

本實驗采用響應面法優(yōu)化了辛烯基琥珀酸酐酯化芋頭淀粉的工藝參數(shù)，具體為：淀粉濃度40%，反應溫度41℃，反應時間2.5 h，pH8.5，在此條件下酯化得到的實際取代度為0.02069，樣品取代效率為68.97%；X 射線衍射及掃描電鏡結(jié)果表明：芋頭淀粉經(jīng)OSA 酯化后，相對結(jié)晶度會降低，但晶型及顆粒表面不會受到明顯影響；OSA 酯化后的芋頭淀粉疏水性增加。結(jié)合芋頭淀粉粒徑較小的特點，其有望用作Pickering 乳化劑，在食品乳化劑、增稠劑、生物醫(yī)藥和緩釋包裝等方面具有廣闊的應用潛力。