三種DNA 提取方法對半滑舌鰨腸道菌群高通量測序結(jié)果的影響

葛侖華，江博赟，孫敬鋒，呂愛軍，胡秀彩，陳麗梅

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）具有肉質(zhì)鮮美、個體大、生長快等優(yōu)良性狀，是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類[1]。近年來隨著工廠化、集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，半滑舌鰨病害發(fā)生頻繁，嚴(yán)重降低了養(yǎng)殖的成活率[2]。腸道菌群在水產(chǎn)動物健康、生長、生理等多個方面發(fā)揮了重要作用，其結(jié)構(gòu)組成與多樣性對宿主健康具有重要影響[3-4]。對半滑舌鰨腸道菌群的研究有助于了解宿主與其腸道菌群之間的相互作用關(guān)系，并為疾病監(jiān)控及預(yù)防提供新思路[5-7]。

近年來，越來越多的研究集中于分析水生動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[8]。早期研究主要是對獲得的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行鑒定分析，但這種方法的應(yīng)用局限于可培養(yǎng)微生物，只能鑒定到少數(shù)的細(xì)菌群落，無法深入了解菌群組成結(jié)構(gòu)[9]。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用高通量測序技術(shù)可以同時對數(shù)百萬個DNA 分子進(jìn)行測序，通過分析微生物的單一基因或全基因組，可以鑒定出大部分腸道菌群的類別[10]。目前具有代表性的高通量測序技術(shù)主要有454 焦磷酸測序、Solexa 聚合酶合成測序、SOLiD 連接酶測序[11]。以Roche 454 和Illumina MiSeq 為代表的高通量測序平臺也已應(yīng)用在半滑舌鰨[5]、對蝦（Penaeus monodon）[12]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[13]等多種水生動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析。

高通量測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為腸道菌群結(jié)構(gòu)分析研究提供了技術(shù)支持。如何高質(zhì)量地從樣品中獲得微生物基因組DNA是運用高通量測序技術(shù)分析腸道菌群的關(guān)鍵步驟。理想的微生物DNA提取方法既要考慮到DNA 產(chǎn)量和純度，又要盡量避免DNA 的降解及降低試劑材料的成本[14]。目前有很多用于提取DNA 的試驗方法，如酶促DNA提取技術(shù)[15]、超聲波破碎技術(shù)[16]、玻璃珠機械裂解技術(shù)[17]、磁性分離技術(shù)[18]。

不同試驗方法提取的DNA，經(jīng)過測序鑒定后，對應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果存在偏差[19]。溫崇慶等[20]用三種不同DNA 提取試劑盒（Omega，美國）提取凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的腸道菌群DNA，并經(jīng)高通量測序分析，得到的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果差異顯著。本試驗室曾以溶菌酶結(jié)合超聲波裂解法（Combination of Lysozyme and Ultrasonic Lysis，CLU）、Zirmil-beating 細(xì)胞破碎法（Zirmil-beating Cell Disruption，ZBC）和德國Qiagen 公司的QIA 試劑盒法（QIA）三種方法提取錦鯉（Cyprinus carpio）腸道菌群DNA，發(fā)現(xiàn)其高通量測序結(jié)果存在差異[21]。但目前不同DNA 提取方法對半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果的影響未見報道。

本研究以CLU、ZBC 和QIA 三種方法提取半滑舌鰨腸道菌群DNA，通過高通量測序技術(shù)分析不同DNA提取方法引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果偏差，旨在為半滑舌鰨腸道菌群多樣性研究方法，特別是DNA 提取策略提供參考資料，同時有助于全面了解健康半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 半滑舌鰨腸道微生物收集

試驗用半滑舌鰨購于天津市某養(yǎng)殖場，體長（30.0±2.5）cm，體重（220.0±6.5）g，將魚運至天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)動物疾病及免疫學(xué)實驗室，在溫度為20 ℃，鹽度為30 的海水中暫養(yǎng)一周，每日投喂顆粒飼料兩次。選取3 尾健康半滑舌鰨用于腸道微生物的收集。首先用75%酒精棉球擦拭魚體表，然后用無菌解剖刀剖開腹腔。從腹腔取出完整腸道，并將腸內(nèi)容物收集至50 mL 離心管中。將樣品與10 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2）混合，渦旋震蕩30 s，然后將懸濁液在4 ℃，150 g 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的無菌50 mL 離心管中。隨后在4 ℃，2 700 g離心5 min，棄上清后獲得沉淀。最后用3 mL PBS重新懸浮沉淀，將腸道菌群懸液平均分為三份，每份1 mL，分別用CLU、ZBC、QIA 三種方法進(jìn)行DNA 提取。

1.2 DNA 的提取

1.2.1 CLU 方法

參照HAN等[22]應(yīng)用CLU方法提取腸道菌群基因組DNA，將DNA 沉淀用1 mL 70%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干，隨后用100 μL 50 ℃預(yù)熱的TE 緩沖液溶解。DNA 放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ZBC 方法

參照J(rèn)IANG 等[23]應(yīng)用ZBC 方法提取菌群基因組DNA，最后將EP 管倒置15 min，待DNA 沉淀風(fēng)干，然后用100 μL TE 緩沖液溶解DNA。DNA放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 QIA 方法

將1 mL 腸道菌群懸液在4 ℃，2 700 g 離心5分鐘，用220 μL PBS 重懸細(xì)菌沉淀。然后應(yīng)用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，德國）提取腸道菌群DNA。最后用100 μL TE 緩沖液洗脫DNA。提取的DNA 放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rDNA 高通量測序

選取16S rRNA 的V3-V4 可變區(qū)基因進(jìn)行PCR 擴增，PCR 擴增所用的引物為341F（5′-CCC TACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGC WGCAG-3′）和805R（5′-GACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）。PCR 反應(yīng)體系包含10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 10 ng，正反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，加無菌超純水至50 μL。PCR擴增反應(yīng)條件如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。然后引入Illumina 橋式PCR 兼容引物進(jìn)行第二輪擴增，反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 20 ng，正反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，加無菌超純水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，使用Qubit 2.0 核酸和蛋白定量儀（Thermo Scientific，美國）對DNA 含量進(jìn)行測定。在每個腸道菌群DNA 樣品中摻入獨特的條形碼，利用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

完成測序后，根據(jù)樣品獨特的條形碼將測序讀數(shù)分配給每個樣品。數(shù)據(jù)分析的方法參照HAN等[21]，首先使用FLASH 合并來自原始DNA 片段的成對讀數(shù)[24]，然后使用質(zhì)量控制程序，包括剪切條形碼和引物、通過PRINSEQ 軟件過濾低質(zhì)量讀數(shù)、校正潛在的測序錯誤、應(yīng)用UCHIME 去除嵌合體[25]。最后，計算Rarefaction，Chao1 和Simpson指數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析，計算加權(quán)UniFrac 度量距離進(jìn)行Beta 多樣性分析。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）分類器[26]對97%相似度水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在門、屬水平，統(tǒng)計各個樣品的菌落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控與OTU 聚類分析

將CLU、ZBC、QIA 三種方法提取的DNA 樣品用于高通量測序分析，得到的測序序列讀數(shù)（filtered-number）分別為32 215、38 745、25 122（表1）。這些序列的平均長度分別為420.0 bp、417.0 bp、418.7 bp。根據(jù)97%的相似性聚類后，所有腸道細(xì)菌樣品共發(fā)現(xiàn)7 516 個OTU（圖1）。CLU、ZBC、QIA 方法對應(yīng)樣品中的OTU 數(shù)量分別為3 761、3 859、2 850（表1），其中三個樣品共有的OTU數(shù)量為881，分別占三種樣本各自O(shè)TU數(shù)量的23.42%、22.82%、30.91%。

表1 三種方法提取的DNA樣品的序列讀數(shù)、OTU、Alpha多樣性指數(shù)

圖1 三種DNA 提取方法對應(yīng)樣品中的OTU 數(shù)目

2.2 Alpha 多樣性分析

三種方法對應(yīng)樣本的稀釋曲線都接近平緩，其中CLU 和ZBC 對應(yīng)樣本呈現(xiàn)相似的趨勢，與QIA 相比，兩者曲線斜率更大（圖2a）。在Alpha多樣性分析中，CLU、ZBC、QIA 方法對應(yīng)的Chao1指數(shù)分別為5 668、5 868、4 090（圖2b），Simpson指數(shù)分別為0.021、0.022、0.018（圖2c），QIA 方法對應(yīng)的Chao1 和Simpson 指數(shù)均低于CLU 和ZBC 方法。

圖2 Alpha 多樣性分析

2.3 半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在門的水平上，三種方法提取的DNA 樣品中共鑒定出31 個細(xì)菌門。其中CLU、ZBC、QIA 方法對應(yīng)樣品分別鑒定到26、29、28 個細(xì)菌門，共有的細(xì)菌門25 個。10 個豐度最高的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（表2）。在CLU、ZBC、QIA 對應(yīng)的樣品中，這10 個優(yōu)勢菌門均被鑒定到，且大部分序列屬于前四種細(xì)菌門（變形菌門、厚壁菌門、螺旋菌門、擬桿菌門），所占比例分別為85.94%、86.88%、83.45%（圖3）。6 個存在差異的菌門為嗜熱絲菌門（Caldiserica）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、軟壁菌門（Tenericutes）、待定菌群（Candidate_division_OD1 和 Candidate_division_WS3）。這些類群均為低豐度菌群，這表明三種方法對一些豐度較低的菌群類別鑒定結(jié)果存在偏差。

圖3 三種方法提取的DNA 樣品中優(yōu)勢菌門相對豐度

表2 三種方法提取的DNA樣品間優(yōu)勢菌門和OTU豐度比較

在屬的水平上，所有樣品序列共鑒定出799個屬。CLU、ZBC、QIA 樣品分別鑒定到593、599、495 個屬，三個樣品共有的細(xì)菌屬362 個。以占樣品平均豐度≥1%的屬作為優(yōu)勢菌屬，CLU 和ZBC各有20 個優(yōu)勢菌屬，其中有14 個優(yōu)勢菌屬為兩者共有；而QIA 有19 個優(yōu)勢菌屬，與CLU、ZBC均共享13 個優(yōu)勢菌屬，三個樣品之間共有的優(yōu)勢菌屬為12 個。其中10 個最高豐度的菌屬為短螺旋體屬（Brevinema）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、肉桿菌屬（Carnobacterium）、類似芽球菌屬（Blastocatella）、乳球菌屬（Lactococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（圖4）。其中CLU、ZBC 方法鑒定到的豐度最高菌屬均為短螺旋體屬（Brevinema），分別占樣品的10.61%和9.15%，這個菌屬在QIA 中僅為2.48%。QIA 方法提取的樣品中豐度最高菌屬為微小桿菌屬（Exiguobacterium），在CLU 中僅為第四優(yōu)勢屬。這表明在門、屬水平上，三種不同DNA 提取方法導(dǎo)致了半滑舌鰨腸道菌群測序分析結(jié)果的差異。

圖4 三種方法提取的DNA 樣品中優(yōu)勢菌屬相對豐度

2.4 Beta 多樣性分析

基于UniFrac 距離計算樣本間的距離矩陣來衡量三種樣本間物種組成的相似度，發(fā)現(xiàn)CLU 和QIA 方法提取的樣品之間的微生物群落結(jié)構(gòu)和物種豐富度更相似（圖5）。

圖5 基于距離的加權(quán)UniFrac 分析三種DNA 樣本相似性

3 討論

3.1 影響DNA 提取效率的因素

高通量測序技術(shù)具有定量準(zhǔn)確和測序深度高的優(yōu)點，能夠更真實地反映菌群結(jié)構(gòu)特征，已廣泛應(yīng)用于分析復(fù)雜的腸道菌群結(jié)構(gòu)[27]。高質(zhì)量的DNA 提取是準(zhǔn)確測序的前提，現(xiàn)已有多種提取腸道菌群基因組DNA 的方法，但提取效率各不相同[28]。無論何種方法，DNA 的提取都需要細(xì)胞裂解和核酸純化兩個步驟，通常是利用物理、化學(xué)或酶解作用裂解細(xì)胞，使DNA 釋放出來，進(jìn)一步純化與裂解體系中其他雜質(zhì)分離。不同提取方法可能對裂解效果具有明顯差異，如何提高細(xì)胞裂解效率是腸道菌群多樣性研究中關(guān)鍵問題。在DNA 提取過程中，不同的細(xì)菌類群（如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌等）對使用的化學(xué)試劑表現(xiàn)出不同程度的抗性[29]。常用的化學(xué)試劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。SDS 是一種陰離子表面活性劑，可與膜脂蛋白作用從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；而CTAB 是一種陽離子去污劑，能夠溶解細(xì)胞膜并與核酸形成復(fù)合物[30]。化學(xué)法具有成本低、DNA 提取產(chǎn)量高、降解少的優(yōu)點[31]。但化學(xué)試劑并不能穩(wěn)定地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，可能會阻礙DNA 釋放或在裂解過程中破壞DNA，這些因素導(dǎo)致微生物群落中不同細(xì)菌類群的低估或高估。以往研究表明，溶菌酶可以選擇性分解微生物細(xì)胞壁而不破壞其他成分[32]，但溶菌酶對革蘭氏陰性菌DNA 提取效率不高[33]。為了解決這一問題，本實驗室利用CLU 方法將溶菌酶和超聲波裂解法結(jié)合以提取不同類群細(xì)菌基因組DNA。在本研究中采用CLU 方法提取的半滑舌鰨腸道菌群DNA 經(jīng)測序分析后，鑒定到較多的細(xì)菌類群。這表明使用適當(dāng)?shù)某暡ㄆ扑樘幚韥砹呀飧锾m氏陰性菌細(xì)胞壁，可以使DNA 有效地釋放。此外，該方法中使用的水解酶、蛋白酶K 和RNase A 的協(xié)同作用也有助于DNA 釋放和純化。

3.2 不同DNA 提取方法引起菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果的差異

迄今，對于魚類腸道菌群基因組DNA 的提取方法尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用三種不同方法提取半滑舌鰨腸道菌群DNA，所得樣品經(jīng)過測定得到的OTU 只有不到50%是共有的。與QIA 樣品相比，CLU 和ZBC 樣品中測定得到的腸道菌群OTU 數(shù)、Alpha 多樣性指數(shù)（Chao1 和Simpson）明顯較高。

在門水平上，螺旋菌門（Spirochaetae）豐度在CLU 和ZBC 樣品中分別為9.18%和10.73%，而在QIA 中僅為2.52%。在屬水平上，短螺旋體屬（Brevinema）的豐度在CLU 和ZBC 樣品中分別為10.61%和9.15%，而在QIA 中僅為2.48%。不同細(xì)菌類群豐度的差異代表相應(yīng)基因序列豐度不同，這可能是由于不同DNA 提取方法對腸道菌群DNA 的提取效率不同。本研究通過三種方法提取DNA，鑒定到的豐度較高的細(xì)菌門類是相同的，但對于低豐度的細(xì)菌門類不能完全鑒定到，在屬的水平上也發(fā)現(xiàn)了相似情況。因此，同時選用多種不同方法提取DNA，用于高通量測序分析，最后得到的菌群組成信息更加全面、準(zhǔn)確。

3.3 半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)特征

三種方法提取的DNA樣品經(jīng)高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨腸道菌群中豐度最高的菌門為變形菌門（Proteobacteria），其次是厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、擬桿菌門（Bacteroidetes），這與張正等[34]的研究結(jié)果相似，表明這些菌門可能是半滑舌鰨腸道內(nèi)核心菌群。本研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨腸道菌群中含有較高豐度的螺旋菌門（Spirochaetae），這與在錦鯉（Cyprinus carpiovar.Koi）[21]和異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[35]中的研究結(jié)果不同。由此推測，不同的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、飲食習(xí)性和生活環(huán)境等因素可能影響魚類腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成。另外，在患病半滑舌鰨中螺旋菌門（Spirochaetae）豐富度明顯降低[36]，這表明螺旋菌門（Spirochaetae）的豐富度可能與半滑舌鰨健康狀況密切相關(guān)。

本研究表明，不同方法提取的DNA 經(jīng)高通量測序分析鑒定到的主要優(yōu)勢菌群類別是一致的，但對一些豐度較低的菌群類別鑒定的結(jié)果存在偏差。此外，本研究揭示了健康半滑舌鰨腸道核心菌群主要包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。研究結(jié)果為半滑舌鰨腸道菌群多樣性研究方法，特別是DNA 提取策略提供了參考資料，同時有助于全面了解健康半滑舌鰨的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。