番茄愈傷組織篩選及抗逆突變體的獲得

何遠(yuǎn)秦，許丁帆，劉艷軍，通信作者，季核亮，趙麗麗，董洪雨

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392；2.天津市耕耘種業(yè)股份有限公司，天津 300408）

番茄（Solanum lycopersium），茄科茄屬植物，果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是世界范圍內(nèi)栽培最為普遍的果菜之一。植物在生長(zhǎng)發(fā)育期間會(huì)受到各種不良環(huán)境因子的影響，其中包括生物脅迫和非生物脅迫[1]。番茄在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及果實(shí)形成過程中對(duì)水分的需求居茄果類蔬菜之首[2]。多數(shù)栽培番茄品種對(duì)干旱脅迫敏感，對(duì)鹽脅迫中度敏感[3]。在如今土壤鹽漬化等環(huán)境問題日趨嚴(yán)重的趨勢(shì)下，培育具有良好抗逆性的番茄品種對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要作用。

經(jīng)過長(zhǎng)期的人工選育，現(xiàn)代番茄栽培種的遺傳背景已變得十分狹窄，因此通過雜交篩選將野生種與栽培種的優(yōu)良農(nóng)藝性狀相結(jié)合是番茄較普遍的抗逆育種途徑[3-4]，然而此種方法存在著育種周期長(zhǎng)和基因資源有限等問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗性基因的定位技術(shù)已經(jīng)在甘蔗、水稻上應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將相應(yīng)的抗性基因?qū)胧卟酥?，可以?chuàng)造出抗逆性育種的新材料[5]。雖然已利用植物基因工程技術(shù)獲得相關(guān)的番茄抗逆性植株，但轉(zhuǎn)基因番茄的安全性、后代持續(xù)抗性、廣譜抗性等還有待進(jìn)一步研究和探討。因此，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)并沒有廣泛應(yīng)用于番茄的生產(chǎn)中[6]。據(jù)研究報(bào)道，在植物組織培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)廣泛的變異情況即體細(xì)胞無性系變異，而體細(xì)胞無性系變異的變異率可以高達(dá)30%～40%，一些具體性狀的變異率可以達(dá)到0.2%～3.0%[7]，故可以通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)愈傷組織進(jìn)行篩選進(jìn)而獲得抗性突變體植株，相關(guān)研究已經(jīng)在多種植物的抗性育種中得到應(yīng)用，但在番茄育種中的應(yīng)用少有報(bào)道[8-9]。

聚乙二醇（PEG）是一種理想的滲透劑，會(huì)降低植物細(xì)胞胞外水勢(shì)，進(jìn)而對(duì)植物細(xì)胞外膜產(chǎn)生脅迫作用[10]。細(xì)胞外膜在受到非生物脅迫的刺激后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的第二信號(hào)分子，進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)膜調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平，產(chǎn)生磷酸化蛋白分子，促進(jìn)與細(xì)胞保護(hù)相關(guān)蛋白或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生，進(jìn)而提升植物細(xì)胞對(duì)逆境的適應(yīng)能力[11]。當(dāng)前PEG 相關(guān)研究大多集中在使用PEG 對(duì)植物種子和幼苗進(jìn)行脅迫和篩選，在愈傷組織研究中的應(yīng)用相對(duì)較少[12-14]。張聰?shù)萚15]在誘變選育菜用甘薯耐旱材料的試驗(yàn)中，使用PEG 對(duì)輻射誘變后的愈傷組織進(jìn)行篩選獲得了耐旱材料。本試驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中添加PEG-8000 造成滲透脅迫，篩選番茄愈傷組織中某些耐滲透突變細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞再生，通過再生植株葉片表型和生長(zhǎng)勢(shì)篩選出突變體。突變植株如經(jīng)過進(jìn)一步抗逆性檢測(cè)驗(yàn)證，可作為番茄育種的抗性種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄盆栽苗品種為‘盛美’，由天津市耕耘種業(yè)股份有限公司提供。番茄盆栽基質(zhì)為V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖＝2∶2∶1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄組培苗的獲取

選取長(zhǎng)勢(shì)一致且健壯的莖段，剪去葉片及部分葉柄，在超凈臺(tái)中剪成2～3 cm 帶一個(gè)腋芽的莖段，70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3 次，每次5 min，然后用含2.0%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒5 min，無菌水沖洗5 次，每次5 min，沖洗后用無菌濾紙吸干外植體表面，并將莖段兩端各剪去約3 mm，接種到不含植物激素的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)。每天觀察腋芽萌發(fā)情況并及時(shí)清除污染苗，經(jīng)過20 d 初代培養(yǎng)，將萌發(fā)的腋芽從基部切下，轉(zhuǎn)接至MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，獲得大量番茄組培苗備用。

1.2.2 番茄組培苗愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)

選取頂芽正常、生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄組培苗，以初展葉片的葉柄為外植體，剪成長(zhǎng)度約0.5 cm 小段，接種到含不同激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS 為基本培養(yǎng)基，改變MS 無機(jī)鹽倍數(shù)、添加不同濃度配比的BA 和2，4-D（見表1），培養(yǎng)基pH 為5.8，碳源為30 g/L 蔗糖，7 g/L 瓊脂粉固化。100 mL 廣口三角瓶每瓶加入約30 mL 培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種6 個(gè)外植體，重復(fù)3次。每天觀察外植體變化及愈傷組織生長(zhǎng)情況，30 d 后記錄并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%＝誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

1.2.3 番茄愈傷組織不定芽分化誘導(dǎo)

將1.2.2 誘導(dǎo)所得的番茄愈傷組織在超凈工作臺(tái)中分割成大小約3 mm×3 mm 的小塊，轉(zhuǎn)接到番茄愈傷組織再生培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基采用MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素（見表2），調(diào)節(jié)pH值為5.8，蔗糖與瓊脂粉用量同1.2.2。每個(gè)處理重復(fù)3 次，一個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種6 塊愈傷組織，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的不定芽分化情況。

不定芽分化率/%＝分化不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)×100

1.2.4 愈傷組織逆境分化誘導(dǎo)

通過1.2.3 確定番茄愈傷組織最佳分化培養(yǎng)基：MS＋1.0 mg/L BA。將愈傷組織分割成大小約3 mm×3 mm 小塊，轉(zhuǎn)接到分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、7%、9% PEG-8000 的最佳分化培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種6 瓶，每瓶接種5 塊愈傷組織，重復(fù)3 次。每天觀察不定芽生長(zhǎng)情況，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織上分化出的不定芽數(shù)。在繼續(xù)培養(yǎng)15 d 后，觀察統(tǒng)計(jì)不定芽的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)勢(shì)正常的不定芽數(shù)量。通過分化出的不定芽的生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷，篩選抗逆性強(qiáng)的不定芽。

不定芽正常生長(zhǎng)率/%＝生長(zhǎng)勢(shì)正常的不定芽數(shù)/愈傷組織分化出的不定芽數(shù)×100

1.3 培養(yǎng)條件

接種后的培養(yǎng)瓶置于組培室內(nèi)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，從愈傷組織誘導(dǎo)率看，除未附加任何激素的MS 培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均誘導(dǎo)獲得了番茄愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，說明以番茄葉柄為外植體易誘導(dǎo)愈傷組織，在培養(yǎng)基中附加一定量2，4-D 即可誘導(dǎo)出愈傷組織；從愈傷組織質(zhì)地與結(jié)構(gòu)看，在只添加2，4-D 的MS 培養(yǎng)基上，番茄愈傷組織生長(zhǎng)迅速，結(jié)構(gòu)松散，但質(zhì)地較軟，表面白色，在顯微鏡下觀察愈傷組織多為薄壁細(xì)胞，液泡大，細(xì)胞質(zhì)??；當(dāng)降低MS 培養(yǎng)基無機(jī)鹽倍數(shù)，使用1/2MS 培養(yǎng)基附加2，4-D 時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度加快，顏色透明，顯微觀察愈傷組織基本由巨大型細(xì)胞組成，這類細(xì)胞一般不能繼續(xù)分裂，只能隨著生長(zhǎng)而解體，不具備再生能力；為獲得能夠再生的愈傷組織，本試驗(yàn)在附加1.0 mg/L 和2.0 mg/L 2，4-D 的MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L BA，比較愈傷組織質(zhì)地，在2.0 mg/L 2，4-D 與1.0 mg/L BA 下誘導(dǎo)的番茄愈傷組織質(zhì)地較硬，結(jié)構(gòu)松散，顏色黃綠色，多由個(gè)體較小，細(xì)胞質(zhì)濃，處于旺盛分裂的細(xì)胞類型組成。綜上所述，MS＋1.0 mg/L BA＋2.0 mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基可誘導(dǎo)出理想的愈傷組織。

表1 番茄葉柄愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 番茄愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)試驗(yàn)

將番茄愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后，在愈傷組織表面產(chǎn)生較多的不定根，之后在部分愈傷組織上出現(xiàn)綠點(diǎn)并逐漸出現(xiàn)不定芽結(jié)構(gòu)。由表2 可知，在不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基上，番茄愈傷組織分化率較低，僅有少數(shù)愈傷組織上出現(xiàn)不定芽，且不定芽生長(zhǎng)速度較慢。在MS 培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L IAA 后，分化率與未加任何激素的MS 培養(yǎng)基無顯著差異，不定芽數(shù)量少，且生長(zhǎng)細(xì)弱。MS 培養(yǎng)基加入一定濃度BA 后，不定芽分化率顯著提高，說明BA 能夠促進(jìn)番茄愈傷組織不定芽分化；番茄愈傷組織不定芽分化率隨BA 質(zhì)量濃度的升高而升高，BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 和2.0 mg/L 時(shí)不定芽分化率均高達(dá)100%，但不定芽生長(zhǎng)情況不同：BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 時(shí)，不定芽健壯且生長(zhǎng)速度快；BA 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時(shí)，大多數(shù)不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，說明高質(zhì)量濃度BA 不利于不定芽生長(zhǎng)。為平衡BA 的影響，在2.0 mg/L BA 的MS 培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L IAA，仍出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象。綜上所述，在MS＋1.0 mg/L BA 培養(yǎng)基上番茄愈傷組織不定芽分化效果最佳。

表2 番茄愈傷組織在不同培養(yǎng)基上的不定芽分化結(jié)果

2.3 番茄不定芽篩選壓力的確定

在分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的PEG-8000模擬滲透脅迫，經(jīng)過30 d 培養(yǎng)后，部分愈傷組織可以分化出不定芽，在繼續(xù)培養(yǎng)15 d 后，大量不定芽生長(zhǎng)勢(shì)減弱甚至死亡，只有少量的不定芽可以繼續(xù)正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3 可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加PEG-8000時(shí)，分化出不定芽的數(shù)量和不定芽正常生長(zhǎng)率顯著高于添加了PEG-8000 的處理，說明PEG-8000能產(chǎn)生明顯的脅迫作用；在培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-8000 后，隨著培養(yǎng)基中PEG-8000質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，愈傷組織分化出的不定芽數(shù)量逐漸減少；當(dāng)PEG-8000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，分化不定芽的數(shù)量與不添加PEG-8000 時(shí)沒有顯著差異，但在繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后正常生長(zhǎng)率僅為1.23%，說明在此條件下的篩選效果不理想；但當(dāng)培養(yǎng)基中PEG-8000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，培養(yǎng)初期，部分愈傷組織可再生出芽點(diǎn)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，芽點(diǎn)逐漸死亡，30 d 時(shí)，在7% PEG-8000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下不定芽正常生長(zhǎng)率僅為 11.11%，在9%PEG-8000 條件下則無不定芽分化，說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG-8000 產(chǎn)生的脅迫效果過強(qiáng)，使得不定芽不能正常分化，起不到篩選的作用；PEG-8000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，不定芽的平均數(shù)量達(dá)到21 個(gè)，但是正常生長(zhǎng)率僅有3.18%，絕大多數(shù)不定芽生長(zhǎng)勢(shì)較弱，可見此濃度條件下篩選效果并不理想；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入5%的PEG-8000 時(shí)，正常生長(zhǎng)的不定芽較多，且不定芽的正常生長(zhǎng)率顯著高于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)，證明此質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下的篩選效果比較理想。將逆境條件下分化得到正常生長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接至添加了5% PEG-8000的MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，在繼代培養(yǎng)過程中，幼苗能正常生長(zhǎng)且沒有出現(xiàn)滲透脅迫下葉片卷曲的現(xiàn)象，可見篩選獲得的幼苗具有一定的抗逆性。篩選獲得的幼苗在基因?qū)用娴母淖冇写M(jìn)一步試驗(yàn)檢測(cè)。

表3 不同PEG-8000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下番茄不定芽生長(zhǎng)比較

3 討論

外源激素的種類和濃度是影響愈傷組織再生的關(guān)鍵因素。有研究表明，不同激素組合及其質(zhì)量濃度對(duì)誘導(dǎo)番茄愈傷組織形態(tài)和不定芽分化存在很大差異[16]。一般來說，具有再生能力的愈傷組織其內(nèi)部已形成不定芽原基或胚性結(jié)構(gòu)，此時(shí)無外源激素作用下也能再生。本試驗(yàn)中，在未添加外源激素的MS 培養(yǎng)基中，番茄愈傷組織先產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)后期才出現(xiàn)少量不定芽，愈傷組織分化率低，可能是因?yàn)橛鷤M織內(nèi)源生長(zhǎng)素含量較高，抑制了芽的分化。在培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L BA 時(shí)，可有效提高愈傷組織分化率，且愈傷組織產(chǎn)生不定根的現(xiàn)象得以緩解。但分裂素質(zhì)量濃度過高，也會(huì)抑制愈傷組織分化和不定芽生長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。本試驗(yàn)中當(dāng)BA 添加量達(dá)到2.0 mg/L 時(shí)，多數(shù)不定芽玻璃化。這與一些表明誘導(dǎo)芽分化最適BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的研究結(jié)果不同[17]，可能是由于番茄愈傷組織中內(nèi)源激素的水平不同造成。趙燕等[18]認(rèn)為IAA 和BA 結(jié)合使用會(huì)提高番茄外植體的再生頻率。而本試驗(yàn)采用2.0 mg/L BA 和0.5 mg/L IAA 誘導(dǎo)愈傷組織分化效果不理想，這可能與番茄基因型、外植體生理狀態(tài)等有關(guān)。

體細(xì)胞無性系變異廣泛存在于植物離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的外源激素、培養(yǎng)環(huán)境等均有可能導(dǎo)致體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生。利用體細(xì)胞無性系變異進(jìn)行突變體篩選，通過在培養(yǎng)基中加入一定的選擇壓力以定向選擇，從而有目的地篩選到特定的突變細(xì)胞系[19]。有研究表明，離體篩選的突變株與田間植株的抗性有一定的相關(guān)性[20]，例如除草劑耐受性、對(duì)生物和非生物脅迫的抗性等。張建華等[8]用NaCl 進(jìn)行直接高鹽脅迫來篩選番茄耐鹽體細(xì)胞變異體，最終得到了在鹽脅迫培養(yǎng)基中芽體的生根率、鮮重及干重均顯著高于原始株的耐鹽植株，在150 mmol/L NaCl 的鹽脅迫下，其幼苗的成活率可達(dá)66%。李永燦[21]以灰霉菌粗毒素為選擇劑直接對(duì)番茄愈傷組織進(jìn)行離體篩選，獲得了對(duì)灰霉病抗性較強(qiáng)的再生植株。以上研究表明，使用選擇劑直接對(duì)愈傷組織進(jìn)行離體篩選也是一種獲取抗性突變體的可行方法。本研究通過在培養(yǎng)基中附加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的PEG-8000，增加培養(yǎng)基滲透壓，給番茄愈傷組織再生創(chuàng)造滲透脅迫條件。在逆境環(huán)境下進(jìn)行再生，使分裂旺盛或適應(yīng)逆境的細(xì)胞表達(dá)胚性從而再生出植株[22]。最后，根據(jù)分化出不定芽的生長(zhǎng)表現(xiàn)進(jìn)行初步選擇，以獲得在滲透脅迫下仍能正常生長(zhǎng)的抗逆性再生植株。綜上所述，本試驗(yàn)通過對(duì)番茄愈傷組織突變細(xì)胞進(jìn)行定向篩選獲取了抗逆性再生植株，可為植物抗性育種提供參考。