淡水小球藻分離培養(yǎng)及其對水體辛硫磷的降解功能研究

孫 陽,黃金秀,呂利群

(1.上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫，上海 201306;2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有機(jī)磷殺蟲劑被廣泛用于殺滅寄生蟲、細(xì)菌等對生產(chǎn)有害的病原微生物[1]。然而，有機(jī)磷殺蟲劑的廣泛應(yīng)用也導(dǎo)致了水體和土壤中的藥物殘留，對環(huán)境安全和人的生命健康構(gòu)成了威脅[2]。辛硫磷是一種有機(jī)磷殺蟲劑，化學(xué)名為Ο-α-氰基亞苯基氨基-Ο，Ο-二乙基硫代磷酸酯。由于辛硫磷在光照下不穩(wěn)定，易分解且殘留期短，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛用于水體中寄生蟲病的防控。有研究表明，辛硫磷在土壤中殘留期較長[3]，長期的用藥積累以及雨水沖刷，土壤殘留辛硫磷匯入水體，可對水生動物產(chǎn)生神經(jīng)毒性、肝臟毒性、生殖毒性以及免疫系統(tǒng)毒性[4-7]。因此，開發(fā)對辛硫磷有效降解的微生態(tài)制劑可以降低辛硫磷的用藥風(fēng)險。農(nóng)藥殘留的降解研究圍繞物理方式、化學(xué)方式和生物降解等多種方式展開，其中生物降解因利用無二次污染且廉價易得的微生物發(fā)揮作用而更受青睞。細(xì)菌在農(nóng)藥的生物降解中扮演先驅(qū)角色，微藻具有吸收環(huán)境中過量營養(yǎng)物質(zhì)的能力，長期以來一直被用于污水處理。20世紀(jì)科研工作者發(fā)現(xiàn)了藻類也能有效降解農(nóng)藥，近年來有關(guān)藻類降解、富集農(nóng)藥的研究不斷深入。有研究表明微藻可以作為一個巨大的代謝池，在去除包括阿特拉津在內(nèi)的農(nóng)藥方面發(fā)揮重要作用[8-9]。藻類主要通過富集與降解發(fā)揮生物降解作用，藻類對農(nóng)藥的富集主要是被動作用，但也有研究表明，主動吸收也起到了重要作用[10]，且藻類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在農(nóng)藥富集過程中同樣起到重要作用[11]。藻類對農(nóng)藥的降解主要體現(xiàn)在藻類將高毒農(nóng)藥轉(zhuǎn)化為低度無毒化合物或是以農(nóng)藥作為磷源、氮源生長[12]。以DDT為代表的有機(jī)氯的降解轉(zhuǎn)化為藻類去除環(huán)境中有機(jī)農(nóng)藥及其他污染物提供新的機(jī)理研究思路。不同藻類降解農(nóng)藥的能力有所不同，研究顯示，相比聚球藻(Synechococcus)、念珠藻(NostoccommuneVauch.)、柵藻(Scenedesmusmeyen)和顫藻(Oscillatoria)等藻類，普通小球藻(Chlorellavulgari)對久效磷、喹硫磷以及甲基對硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥有更好的降解效果[12-14]。廢水中高濃度的農(nóng)藥具有潛在的毒性，可抑制微藻的生長。隨著農(nóng)藥濃度降解到一個相當(dāng)?shù)偷乃?，其幾乎不能對微藻生長產(chǎn)生不良影響，表明只有在非毒性濃度時農(nóng)藥才能被藻類降解，在農(nóng)藥毒害作用下藻類幾乎不能發(fā)揮任何降解作用[15]。鑒于小球藻在有機(jī)農(nóng)藥及其他污染物的生物修復(fù)中的重要作用，研究了有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷對一株淡水蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的毒性作用以及非毒性濃度下該藻株對辛硫磷的吸附和降解作用。對有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性作用以及藻類在非毒性濃度下對有機(jī)磷的吸附降解進(jìn)行深入拓寬研究，這對于了解污水處理廠或徑流中有機(jī)磷農(nóng)藥的生物積累和降解具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 水樣采自上海海洋大學(xué)校園淡水湖明湖(N30°53′14.33″，E121°53′35.38″)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①HB-4水生四號培養(yǎng)基(HB-4)[16]：Ca(H2PO4)2·H2O+2(CuSO4·H2O) 30 mg/L，(NH4)2SO420 mg/L,MgSO4·7H2O 80 mg/L，NaHCO310 mg/L，KCl 2.5 mg/L，F(xiàn)eCl3(1%) 0.15 mL，土壤提取液0.5 mL(土壤提取液購自索萊寶)。②分離純化培養(yǎng)基：HB-4水生四號培養(yǎng)基+1.0%瓊脂。調(diào)節(jié)pH值為6～7，高壓蒸汽滅菌，待其冷卻至60 ℃左右時，加入氨芐青霉素，使其終濃度為0.05 g/L,無菌條件下倒平板備用。

1.1.3 試劑與儀器 DNA secure Plant Kit試劑盒(TIANGEN)、甲醇(HPLC級)、二氯甲烷(AR級)、超純水、高純氮、辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品(99.99%)，購自Sigma公司。液相色譜儀(LC100，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜柱(ODS-SP，GL Sciences公司)；恒溫光照培養(yǎng)箱(ZQLY-180GE，上海知楚儀器有限公司)；0.22 μm有機(jī)系針頭式過濾器(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藻細(xì)胞富集 取水樣100 mL,先經(jīng)篩絹網(wǎng)過濾除去大型浮游生物和懸浮物，然后將濾液分裝至50 mL離心管內(nèi),5 000 r/min離心15 min濃縮水樣，棄去上清液,加入無菌水振蕩使藻細(xì)胞懸浮,真空抽濾，濾膜孔徑為0.22 μm。用無菌水多次沖洗濾膜上的樣品，并將樣品轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，瓶中加入150 mL 滅菌的HB-4培養(yǎng)基。將錐形瓶置于光照恒溫培養(yǎng)箱中，27 ℃，3 000 lx培養(yǎng)1～2周，每天搖晃3～5次，每次輕搖100下，仔細(xì)觀察瓶內(nèi)生物的生長變化情況。

1.2.2 藻細(xì)胞分離 將上述富集得到的混合藻液經(jīng)充分稀釋后(1×PBS稀釋)涂布于分離純化培養(yǎng)基，恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置，20 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx培養(yǎng)兩周后可見有藻集結(jié)體出現(xiàn)，將該藻株命名為MH-1，鏡檢確認(rèn)后將單個藻落于無菌條件下轉(zhuǎn)移至5 mL HB-4培養(yǎng)基中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，25 ℃，3 000 lx條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。目測藻液顏色至深綠色時進(jìn)行下一步接種培養(yǎng)。

1.2.3 種屬鑒定 采用 18S rDNA 方法確定經(jīng)分離純化得到的藻集結(jié)體的種屬。利用DNA secure Plant Kit 試劑盒提取藻細(xì)胞基因組DNA，PCR 擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件參考梁穎等[17]，PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司，測序結(jié)果經(jīng) NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定。

1.2.4 蛋白核小球藻MH-1的培養(yǎng) 按照5%、15%和25%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種MH-1新鮮藻液于HB-4培養(yǎng)基，光照恒溫培養(yǎng)，28 ℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，光暗比12∶12 h，每日手動搖晃培養(yǎng)器皿3～5次，避免藻集結(jié)體黏附在瓶壁。每隔24 h取樣，紫外分光光度計波長680 nm條件下以HB-4培養(yǎng)基為參比，測定藻液光密度以表示藻細(xì)胞生物量，實(shí)驗(yàn)用藻細(xì)胞個數(shù)為(4～5)×106個/mL。

1.2.5 辛硫磷對蛋白核小球藻MH-1的安全濃度 在裝有200 mL藻液的錐形瓶中，加入辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其質(zhì)量濃度分別為2、5、10、15 μg/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行，同時設(shè)置不加藥劑組與助溶劑甲醇組為對照。將上述容器置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，28 ℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，光暗比12∶12 h進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24 h定時取樣，紫外分光光度計680 nm條件下，以HB-4培養(yǎng)基為參比，測定藻液光密度以表示藻細(xì)胞生物量。同時取適量藻液，分光光度法[18]測定葉綠素a含量。

1.2.6 藻液中藥劑含量的測定 將不同體積辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)工作液分別置入含有160 mL藻液的250 mL錐形瓶中，得到兩組含辛硫磷質(zhì)量濃度分別為0.2和2.0 μg/mL的藻溶液，另設(shè)置不加藻細(xì)胞的含辛硫磷溶液為空白。定時搖晃樣品，按照設(shè)定的時間從每個樣品中取出15 mL溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取濾液10 mL轉(zhuǎn)移至50 mL棕色避光離心管中，加入20 mL二氯甲烷分4次萃取(5+5+5+5)，合并萃取所得有機(jī)相，室溫下氮吹，殘渣用1 mL甲醇充分溶解，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中以備HPLC檢測。該處理方法的添加回收率為75.76%～91.18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.65%～3.82%。所有樣品設(shè)3個平行。

1.2.7 藻細(xì)胞富集藥物量的測定 將已測定光密度的藻液于 4 000 r/min 離心 5 min，棄去上清，PBS洗滌3次，再將離心管倒置滴干，加入3 mL二氯甲烷于離心管內(nèi)，超聲波細(xì)胞破碎儀低溫破碎 5 min，直到鏡檢無完整藻細(xì)胞為止。用HPLC級甲醇補(bǔ)充至 4 mL，漩渦震蕩混勻，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾以備HPLC檢測。藻細(xì)胞對藥物的富集量用mg/g FW表示，即每克濕重藻細(xì)胞能夠富集到的藥物毫克數(shù)。

1.2.8 對照試驗(yàn) 進(jìn)行對照試驗(yàn)以增加試驗(yàn)的可靠性。添加辛硫磷溶液于HB-4培養(yǎng)基，使終質(zhì)量濃度達(dá)到0.2、2.0 μg/mL，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于同樣的時間點(diǎn)采集培養(yǎng)液，以確定藻細(xì)胞以外因素對辛硫磷降解的影響。

1.2.9 液相色譜條件V流動相甲醇∶V水=75∶25，色譜柱C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，進(jìn)樣量20 μL，波長280 nm，柱溫室溫，流速1.0 mL/min。本實(shí)驗(yàn)條件下，辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為15.10 min。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GraphPad prism 8軟件進(jìn)行誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻的分離鑒定

劃線培養(yǎng)3代后，無菌條件下挑取藻集結(jié)體進(jìn)行純化培養(yǎng)。在平板上得到單個藻集結(jié)體，利用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，其形態(tài)如圖1所示，單個藻集結(jié)體呈規(guī)則圓形，有凸起，邊緣整齊光滑，嫩綠色。利用甲醛固定液將藻細(xì)胞固定于平板上，于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見單個藻細(xì)胞呈球形，無鞭毛，特征顏色為綠色。鏡檢結(jié)合18S rDNA鑒定分離藻種MH-1為蛋白核小球藻。

圖1 光學(xué)顯微鏡下的藻集結(jié)體(A)與藻細(xì)胞(B)Fig.1 Microscopic view of algal colonies(A) and algal cells(B)

2.2 蛋白核小球藻MH-1的生長過程

蛋白核小球藻MH-1在HB-4培養(yǎng)基中的生長情況如圖2所示。當(dāng)初始藻株生物量較高時(15%和25%)，蛋白核小球藻MH-1生長迅速，培養(yǎng)3 d，吸光度升高了0.24～0.32，生長百分率為222.06%～248.87%。而5%接種量條件下，3 d內(nèi)生長較為緩慢，自第4天起，生長速度逐漸加快，第5天時其生長百分率為829.86%，第6天時為1 129.68%。三種接種量條件下，蛋白核小球藻MH-1的生長百分率在第5天轉(zhuǎn)向第6天時均表現(xiàn)了高于其他時間段的顯著增長，所以在第5天時蛋白核小球藻MH-1的生長速度最快，即最佳生長時間為5 d。

圖2 蛋白核小球藻MH-1的生長情況Fig.2 Growth curve of MH-1

2.3 辛硫磷對蛋白核小球藻MH-1生長的影響

2.3.1 藻細(xì)胞量的變化 不同質(zhì)量濃度的辛硫磷處理下，蛋白核小球藻MH-1的生長過程見圖3。在低質(zhì)量濃度2 μg/mL時，48 h內(nèi)小球藻生長與對照組基本無異，96 h后生長較為緩慢，并逐漸接近穩(wěn)定水平，說明低濃度辛硫磷在短時間內(nèi)對蛋白核小球藻生長無抑制作用，隨著時間推移，開始顯示出一定抑制作用。當(dāng)辛硫磷質(zhì)量濃度在5 μg/mL以上時，藻細(xì)胞生長自24 h后受到明顯抑制，96 h內(nèi)緩慢生長，120 h繼續(xù)生長，藻生物量顯著低于對照組，高濃度辛硫磷對蛋白核小球藻生長產(chǎn)生顯著抑制作用。

圖3 不同辛硫磷初始濃度下蛋白核小球藻MH-1細(xì)胞的增長曲線Fig.3 Growth curves of MH-1 at the four different concentrations of phoxim

2.3.2 葉綠素a含量的變化 以葉綠素a含量 (μg/mL) 為指標(biāo)，測定了對照組和辛硫磷處理?xiàng)l件下蛋白核小球藻MH-1的生長情況(圖4)。結(jié)果顯示，相比空白對照組，48 h內(nèi)2 μg/mL辛硫磷產(chǎn)生的抑制作用并不明顯，48 h后逐漸出現(xiàn)顯著影響。5～10 μg/mL辛硫磷處理下，葉綠素a的含量自24 h起顯著減少。120 h內(nèi)15 μg/mL辛硫磷完全抑制藻體生長，葉綠素a含量幾乎沒有變化。在高濃度辛硫磷作用下，藻液顏色由綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，推測可能與藻細(xì)胞葉綠素合成受阻有關(guān)。48 h后大量藻細(xì)胞開始沉淀死亡，藻體顏色轉(zhuǎn)向灰黑色，說明藻細(xì)胞的生長受到嚴(yán)重阻礙，辛硫磷對藻細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。

圖4 不同濃度辛硫磷處理下蛋白核小球藻MH-1葉綠素a變化Fig.4 The changes in chlorophyl a of Chlorella pyrenoidosa MH-1 treated with phoxim at different concentrations***P<0.001，表示差異極顯著***P<0.001,means difference is significant at the 0.001 level

2.4 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用甲醇將辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品分別配制為100、50、20、10、5 μg/mL等一系列質(zhì)量濃度，經(jīng)HPLC測定，得到質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為y=50.261x - 4.612 1，R2=0.999 6。在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，辛硫磷質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。在辛硫磷降解試驗(yàn)中使用該方程并結(jié)合外標(biāo)法進(jìn)行了質(zhì)量濃度計算。

圖5 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Stand curve of phoxim

2.5 培養(yǎng)基中辛硫磷的降解

對照試驗(yàn)中，5 d內(nèi)辛硫磷在HB-4培養(yǎng)基中的降解動態(tài)如圖6所示。由圖6可知，0.2 μg/mL處理組在5 d后辛硫磷質(zhì)量濃度降低至0.08 μg/mL，減少了43.92%。2.0 μg/mL處理組，5 d后辛硫磷質(zhì)量濃度降低至0.76 μg/mL，減少了59.16%，可知辛硫磷在光照下易于分解，且隨著質(zhì)量濃度的升高，辛硫磷因光降解和水解等因素引起的濃度降低效果將更加明顯。

圖6 辛硫磷在HB-4培養(yǎng)基中的降解動態(tài)Fig.6 Degradation of phoxim in HB-4 medium

2.6 蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷的降解

蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷的降解動態(tài)見圖7。無論是在辛硫磷低濃度還是高濃度處理下，藻液中辛硫磷的濃度隨著時間的延長均明顯減少。初始質(zhì)量濃度為2.0、0.2 μg/mL時，5 d內(nèi)總降解率分別為98.61%和93.58%，扣除空白降解率，其凈降解率分別為39.61%和49.66%，日平均降解速率分別為0.38和0.02 μg/mL?？梢姡?dāng)環(huán)境中辛硫磷含量在安全濃度內(nèi)時，其濃度越高，蛋白核小球藻MH-1對其日降解速率越高，但對低濃度辛硫磷有更高的凈降解率。

圖7 蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷的降解動態(tài)Fig.7 Biodegradation of phoxim by MH-1

2.7 蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷的吸附

如圖8所示，蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷存在顯著的富集作用，其富集量隨辛硫磷濃度的變化有明顯差異，但其變化趨勢一致。24 h內(nèi)，小球藻對辛硫磷的富集量持續(xù)上升，24 h時富集量分別為0.20 mg/g FW(2.0 μg/mL)和0.07 mg/g FW(0.2 μg/mL)。之后3 d內(nèi)富集量呈現(xiàn)下降趨勢。72 h后富集量開始呈上升趨勢，120 h時富集量最高分別可達(dá)0.25 mg/g FW和0.16 mg/g FW。在測量周期內(nèi)，蛋白核小球藻MH-1對環(huán)境中辛硫磷的富集量整體呈升高趨勢，120 h時富集量最高。

圖8 蛋白核小球藻MH-1富集辛硫磷的變化動態(tài)Fig.8 Changes of phoxim amount accumulated by MH-1 with time at the two different concentrations

3 討 論

有機(jī)磷農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最普遍的殺蟲劑種類之一,具有高效、廣譜以及不易殘留等特點(diǎn)[19],但不規(guī)范、不科學(xué)的用藥則會危害到生態(tài)環(huán)境甚至人類健康。我國自2007年起，甲胺磷等高毒有機(jī)磷農(nóng)藥開始明令禁止生產(chǎn)，近年來有機(jī)磷農(nóng)藥的生產(chǎn)及使用主要為敵百蟲、氧化樂果、辛硫磷和馬拉硫磷等低毒藥物。農(nóng)藥對藻類的毒性強(qiáng)弱主要取決于農(nóng)藥自身的理化性質(zhì)，此外也會受到藻種類型以及各種環(huán)境因子的影響。Katagi[20]報道200 μg/mL以上處理后，馬拉硫磷對藍(lán)綠藻 (Cyanobacteria) 的生長可產(chǎn)生顯著且長期的抑制作用，而在一些報道中，僅0.075 μg/mL的樂果與0.5 μg/mL的二甲硫吸磷就可以完全抑制柵藻的生長[21]。本研究中，辛硫磷質(zhì)量濃度在2 μg/mL以上時，可顯著抑制小球藻的生長且在24 h后使其失綠，隨后藻細(xì)胞死亡沉淀，這與劉仁杰等[22]所報道的結(jié)果相似。

葉綠體是微藻光合作用的主要部位，包括光收集、能量轉(zhuǎn)換和光能轉(zhuǎn)換。因此，葉綠素的合成是藻類在環(huán)境脅迫下生長的敏感生物標(biāo)志物[23-24]。本研究中，隨著辛硫磷濃度的升高，藻細(xì)胞葉綠素含量急劇下降，高濃度辛硫磷使藻液顏色在24 h后開始轉(zhuǎn)為藍(lán)色，隨著時間推移綠色逐漸褪去且有明顯藻體沉淀懸浮。當(dāng)暴露在不同類型的藥物下時，藻細(xì)胞葉綠素含量變化差異較大，本研究結(jié)果可以證明辛硫磷對小球藻的毒性可能導(dǎo)致藻細(xì)胞葉綠素含量降低。

藻類是水體食物鏈的關(guān)鍵部分，也是一類對于有毒有機(jī)化合物歸趨起著重要作用的微生物。自1957年Oswald等[25]首次提出將藻類應(yīng)用于有機(jī)污染污水處理，其后相繼有研究報道藻類對除草劑和殺蟲劑[26-27]、酚類[28]以及多環(huán)芳烴類[29]具有降解和轉(zhuǎn)化的能力。葛麗云等[30-31]發(fā)現(xiàn)普通小球藻能夠促進(jìn)水體中17 β-雌二醇和苯胺的降解，其中由小球藻引起的光降解發(fā)揮主要作用。遲杰等[32]研究結(jié)果顯示，6 d內(nèi)普通小球藻對鄰苯二甲酸酯類化合物DBP的富集率和降解率分別為42.0%和11.0%。本研究結(jié)果表明，當(dāng)辛硫磷質(zhì)量濃度在0.2和2.0 μg/mL時，蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷的降解率為49.66%和39.61%，日降解率分別為0.02和0.38 μg/mL?？梢姰?dāng)濃度升高時，降解率反而有所降低，這可能是因?yàn)楦邼舛刃亮蛄酌{迫下蛋白核小球藻MH-1生長受到抑制，從而引起藻生物量降低，富集和降解效果隨之降低。藻細(xì)胞對辛硫磷的富集量在24 h持續(xù)上升，在檢測周期內(nèi)，在0.2和2.0 μg/mL辛硫磷處理下蛋白核小球藻MH-1對其富集量最高分別可達(dá)0.16和0.25 mg/g FW，這一結(jié)果與鷗曉明等[33]的研究結(jié)果相似。

綜上，當(dāng)水體辛硫磷質(zhì)量濃度在2.0 μg/mL以上時，可對蛋白核小球藻MH-1產(chǎn)生明顯毒性作用，在0.2～2.0 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蛋白核小球藻MH-1對辛硫磷具有良好的降解效果，最高降解率可達(dá)49.66%，最高日降解率可達(dá)0.38 μg/mL，藻細(xì)胞對藥劑的吸附效率最高可達(dá)0.25 mg/g FW。本研究表明，蛋白核小球藻MH-1可以用于水體辛硫磷藥物殘留的生物修復(fù)。