花葉唐竹不同表型葉片間抗氧化功能差異分析

陶 蕓，陳凌艷，鄭郁善

(1.福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)園林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

花葉唐竹(Sinobambusatootsikf.luteoloalbostriata)為禾本科(Gramineae)唐竹屬(Sinobambusa)植物。該竹種株型美觀，葉色獨(dú)特，是十分重要的觀賞竹類[1-2]。彩葉植物作為一種特殊的植物材料，已經(jīng)廣泛用于葉綠體發(fā)育、綠色部分同色葉部分細(xì)胞信息傳遞方面的研究[3]。擬南芥葉色突變體im和var2的綠色和白色部分相較于野生型顯示出綠色部分在糖類代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)方面功能的增強(qiáng)[4]。Peltzer等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)白化體部分能合成絕大部分抗氧化物質(zhì)。在前人的許多關(guān)于葉色突變體的研究中已經(jīng)證明在黃色或白色葉肉細(xì)胞中存在著葉綠體發(fā)育缺陷[7-8]。陳凌艷等[9]發(fā)現(xiàn)銀絲竹白色葉片形成的原因在于白色葉肉細(xì)胞葉綠素合成受阻，進(jìn)一步阻礙了葉綠體類囊體的形成。在已有研究中發(fā)現(xiàn)，花葉唐竹的白色葉肉細(xì)胞均存在葉綠體結(jié)構(gòu)缺陷，且葉綠素合成途徑受阻于糞卟啉[10]；全白葉(Whole White Leaf，WW)、全綠葉(Whole Green Leaf，WG)和條紋葉(Striped Leaf，SL)的光合效率存在顯著差異，其中全白葉(WW)最低[11]。目前關(guān)于花葉唐竹不同表型葉片的抗氧化功能差異研究還尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過研究花葉唐竹不同葉色表型間GSH和ROS含量差異，MDA含量差異以及抗氧化酶活性的差異，分析不同葉片表型的抗氧化能力差異，為進(jìn)一步從分子層面解析花葉唐竹不同表型葉片的抗衰過程及不同表型葉片基因表達(dá)差異提供生理基礎(chǔ)，為彩葉竹種的新品種選育提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

圖1 花葉唐竹3種表型葉片

試驗(yàn)材料花葉唐竹植株20株，于2016年4月購于福州市清芳園苗圃，栽培于福建農(nóng)林大學(xué)竹類研究所大棚中，為4年生分株苗。2020年4月選擇花葉唐竹當(dāng)年生枝條上完全展開的葉片進(jìn)行試驗(yàn)，選擇的葉片包括條紋葉(SL)、全綠葉(WG)、全白葉(WW)3種表型(圖1)。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)要求，將全白葉(WW)、全綠葉(WG)、條紋葉(SL)、條紋葉中的白色部分(White part of SL，SW)和綠色部分(Green part of SL，SG)各2 g分別收集、洗凈并迅速置于液氮中并研磨成粉末，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷胱甘肽(GSH/GSSG)含量的測(cè)定與分析 使用試劑盒(中國蘇州，科銘)，按照試劑盒的說明書測(cè)定GSSG和GSH的含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。稱取花葉唐竹5種葉色表型葉片粉末各0.2 g，按照試劑盒的說明書測(cè)定樣品的谷胱甘肽含量。

表1 花葉唐竹谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 花葉唐竹ROS的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 抗氧化酶活性測(cè)定

1)ASA—GSH循環(huán)中的抗氧化酶活性測(cè)定。APX和GR活性的測(cè)定均采用試劑盒(中國蘇州，科銘)。稱取花葉唐竹5種葉色表型葉片粉末各0.2 g，按照試劑盒說明書測(cè)定APX和GR活性。

2)其它抗氧化酶活性測(cè)定。SOD、POD、CAT活性的測(cè)定均采用試劑盒(中國蘇州，科銘)。稱取花葉唐竹5種葉色表型葉片粉末各0.2 g，按照試劑盒說明書測(cè)定SOD、POD、CAT活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析和LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，圖表采用Origin 9.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 花葉唐竹不同表型葉片谷胱甘肽(GSH)含量差異

2.2 花葉唐竹不同表型葉片活性氧(ROS)和脂膜過氧化水平差異

通過測(cè)定花葉唐竹的ROS和MDA水平，比較不同表型葉片之間的氧化脅迫的程度與抗氧化能力的差異，結(jié)果見圖3～圖5。

不同小寫字母為差異顯著,下同。圖2 花葉唐竹不同葉片表型谷胱甘肽含量差異 圖3 花葉唐竹不同葉片表型O-2含量差異

2.2.2 花葉唐竹不同表型葉片脂膜過氧化水平差異 由圖5可知，花葉唐竹不同表型葉片的MDA含量總體表現(xiàn)為全綠葉(77.45 nmol·g-1)>條紋葉綠色部分(52.12 nmol·g-1)>條紋葉(38.43 nmol·g-1)>條紋葉白色部分(21.78 nmol·g-1)>全白葉(19.04 nmol·g-1)。其中，全綠葉的MDA含量顯著高于其它表型；在條紋葉中綠色部分MDA含量顯著高于白色部分，是白色部分的2.22倍。MDA是衡量細(xì)胞過氧化程度的重要指標(biāo)，花葉唐竹白色部分MDA顯著低于綠色部分，這可能是由于白色葉肉細(xì)胞的活性氧含量處于較低水平，沒有引發(fā)脂膜過氧化作用。

圖4 花葉唐竹不同葉片表型H2O2含量差異圖5 花葉唐竹不同葉片表型間丙二醛含量差異

2.3 花葉唐竹不同表型葉片抗氧化酶活性差異

2.3.1 花葉唐竹不同葉片表型ASA—GSH循環(huán)中的抗氧化酶含量差異 由圖6可知，APX和GR是2種與ASA—GSH循環(huán)相關(guān)的抗氧化酶，在花葉唐竹中，兩者活性水平見圖6?；ㄈ~唐竹5種葉色表型APX活性差異總體表現(xiàn)為：全白葉(0.65 U·mg-1prot)>條紋葉(0.50 U·mg-1prot)>全綠葉(0.29 U·mg-1prot)，且差異顯著；條紋葉中白色部分APX活性(0.54 U·mg-1prot)顯著大于綠色部分(0.28 U·mg-1prot)，是綠色部分的2.02倍。花葉唐竹5種葉色表型GR活性差異總體表現(xiàn)為：全白葉(0.079 U·mg-1prot)>條紋葉(0.044 U·mg-1prot)>全綠葉(0.037 U·mg-1prot)，且差異顯著；條紋葉中白色部分GR活性(0.067 U·mg-1prot)顯著高于綠色部分(0.030 U·mg-1prot)，是綠色部分的2.23倍。

圖6 花葉唐竹不同葉片表型ASA—GSH循環(huán)中的抗氧化酶含量差異圖7 花葉唐竹不同葉片表型間抗氧化酶含量差異

2.3.2 花葉唐竹不同葉片表型間抗氧化酶含量差異 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)是重要的抗氧化酶，協(xié)同起清除活性氧的作用。由圖7可知，花葉唐竹不同葉片表型中3種抗氧化酶活性水平也呈現(xiàn)顯著差異。POD活性在不同葉色表型中的總體趨勢(shì)為：全白葉(233.14 U·mg-1prot)>條紋葉(141.46 U·mg-1prot)>全綠葉(115.32 U·mg-1prot)，且差異顯著；條紋葉中的白色部分POD活性(179.29 U·mg-1prot)顯著高于綠色部分(89.75 U·mg-1prot)，是綠色部分的2.00倍。SOD活性在不同葉色表型中差異顯著，總體趨勢(shì)為：全白葉(80.62 U·mg-1prot)>條紋葉(43.55 U·mg-1prot)>全綠葉(18.80 U·mg-1prot)，條紋葉中白色部分SOD活性(62.24 U·mg-1prot)顯著高于綠色部分(23.73 U·mg-1prot)，是綠色部分的2.62倍。CAT活性在不同葉色表型中差異顯著，總體趨勢(shì)為：全綠葉(68.61 U·mg-1prot)>條紋葉(58.12 U·mg-1prot)>全白葉(26.13 U·mg-1prot)，條紋葉中綠色部分CAT活性(48.38 U·mg-1prot)顯著高于白色部分(21.78 U·mg-1prot)，是白色部分的2.22倍。白色部分的活性顯著低于綠色部分可能是因?yàn)榛ㄈ~唐竹葉片中H2O2的含量在綠色葉肉細(xì)胞中顯著高于白色葉肉細(xì)胞，因此綠色葉肉細(xì)胞需要合成更多的CAT來清除H2O2?？傮w來說，白色葉肉細(xì)胞的APX、GR、POD、SOD活性均顯著高于綠色葉肉細(xì)胞，有更強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

總體而言，花葉唐竹白色葉肉細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗氧化功能，白色葉肉細(xì)胞中的抗氧化酶(APX、GR、POD、SOD)活性顯著高于綠色葉肉細(xì)胞，同時(shí)葉片中ROS活性氧含量顯著下降，保護(hù)了細(xì)胞。本研究結(jié)果進(jìn)一步解析了花葉唐竹條紋葉片白色葉肉細(xì)胞中的抗衰過程，即白色部分細(xì)胞可能通過某些代謝物作為信號(hào)，增強(qiáng)了白色葉肉細(xì)胞對(duì)氧化脅迫的防御機(jī)制來保證自己的存活。