經(jīng)典名方半夏厚樸湯物質(zhì)基準量值傳遞分析△

李玲玲，陳盛君，李松，祝倩倩，王協(xié)和，李媚，文紅梅

1.南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023；

2.江陰天江藥業(yè)有限公司技術中心，江蘇 江陰 214434；

3.江蘇省中藥配方顆粒制備與質(zhì)量控制關鍵技術重點實驗室，江蘇 江陰 214434；

4.江蘇省中藥配方顆粒工程技術中心，江蘇 江陰 214434

半夏厚樸湯出自漢代張仲景的《金匱要略》，全方由半夏、厚樸、茯苓、紫蘇和生姜組成，具有行氣散結(jié)、降逆化痰的功效，是治療因情志不遂、肝氣郁滯、痰氣互結(jié)、停聚于咽所致“梅核氣”的經(jīng)典名方[1]?！懊泛藲狻倍喟l(fā)于成年女性，常見于現(xiàn)代醫(yī)學的咽神經(jīng)官能癥、咽異感癥、慢性咽炎等[2]?，F(xiàn)代臨床研究表明，半夏厚樸湯還具有治療胃食管反流病、慢性胃炎、功能性消化不良、哮喘、咳嗽、慢性咽炎及抑郁等作用，尤其在抗抑郁及改善胃腸功能等方面效果顯著[3-9]。

關于半夏厚樸湯的研究多集中于復方加減聯(lián)合化學藥的現(xiàn)代臨床應用，目前尚未有其物質(zhì)基準量值傳遞的相關文獻報道。本研究以半夏厚樸湯為研究對象，選取道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)多批樣品，按照古法進行煎煮，制備物質(zhì)基準，建立復方超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜，以野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚為定量指標，建立半夏厚樸湯物質(zhì)基準質(zhì)量標準，為后續(xù)制劑的工藝研究和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2L-YMW 型機械分體煎藥壺（潮州市港鈿工藝制作廠）；JE502 型電子天平、JSB3-01 型電子秤（上海浦春計量儀器有限公司）；ACQUITY-UPLCH-Class 型色譜儀（Waters 公司）；Vanquish F 型超高效液相色譜儀（Thermo 公司）；ME204 型百萬分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16C型高速臺式離心機（無錫樓蘭儀器系統(tǒng)有限公司）；PO Lab plus-L 型純水系統(tǒng)（Satorius公司）。

1.2 試藥

對照品野黃芩苷（批號：110842-201709，純度：91.7%）、迷迭香酸（批號：111871-201505，純度：98.5%）、厚樸酚（批號：110729-201714，純度：100.0%）、和厚樸酚（批號：110730-201614，純度：99.3%）、咖啡酸（批號：110885-200102，純度：99.7%）、6-姜辣素（批號：111833-202007，純度：99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS000711，純度＞95%）；甲醇、乙腈、磷酸、甲酸均為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

本研究所用的半夏、厚樸、茯苓、紫蘇葉、生姜均購于各自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司工程師唐波鑒定，半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥樹皮、根皮及枝皮，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，紫蘇葉為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉，生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖。利用Excel 表格隨機組合方式形成15 批半夏厚樸湯飲片組合，編號為S1～S15（表1）。

表1 15批半夏厚樸湯飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 物質(zhì)基準的制備

通過飲片炮制、處方劑量考證確定處方藥味及用量，根據(jù)《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》及古籍記載內(nèi)容[10]，對煎煮瓦數(shù)、濾過目數(shù)、是否加蓋、濃縮溫度4個因素進行考察，確定半夏厚樸湯物質(zhì)基準制備的工藝參數(shù)。

注：15批生姜的產(chǎn)地均為云南。

按處方比例分別稱取姜半夏15 g、姜厚樸9 g、茯苓12 g、紫蘇葉6 g、生姜15 g 置于煎藥壺中，加水1400 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持沸騰至約800 mL，過200 目篩，65 ℃條件下減壓濃縮至約580 mL，冷凍干燥得半夏厚樸湯凍干粉（1 g凍干粉相當于7.03～12.62 g生藥量）。同法制備多批凍干粉及缺姜半夏陰性樣品、缺姜厚樸陰性樣品、缺茯苓陰性樣品、缺紫蘇葉陰性樣品、缺生姜陰性樣品及各單味藥樣品。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1色譜條件 采用ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～13 min，2%～17%A；13～19 min，17%A；19～38 min，17%～34%A；38～42 min，34%A；42～55 min，34%～40%A；55～68 min，40%～90%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為280 nm。

2.2.2供試品溶液制備 取本品凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。同法分別制備缺姜半夏、缺姜厚樸、缺茯苓、缺紫蘇葉、缺生姜陰性樣品溶液。

2.2.3精密度試驗 取半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，按照2.2.1 項下色譜條件重復進樣6次，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復性試驗 平行制備6 份半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，按照2.2.1 項下色譜條件測定，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明該方法的重復性較好。

全面訓練。高三復習不能只注重重點知識，從今年的高考命題可以看出，有些知識來源于教材的細微之處，如若復習過程不全面，可能會造成重大失誤。

2.2.5穩(wěn)定性試驗 取半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h進樣測定，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.615批半夏厚樸湯特征圖譜 特征圖譜可較全面反映中藥復方所含化學成分的種類及數(shù)量，實現(xiàn)整體質(zhì)量控制。按照2.2.2項下方法制備半夏厚樸湯物質(zhì)基準S1～S15供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄UPLC圖，將S1～S15樣品色譜圖以.cdf格式導入“中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版），采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1 min，進行全譜峰匹配，共發(fā)現(xiàn)12個共有峰（圖1），相對保留時間的RSD均小于2.0%。以對照圖譜計算半夏厚樸湯物質(zhì)基準相似度（表2），S10 相似度＜0.90，其余相似度均大于0.90，測定發(fā)現(xiàn)該批和厚樸酚、厚樸酚峰面積較小，可能與不同批厚樸飲片含量差異有關。

表2 15批半夏厚樸湯物質(zhì)基準共有峰相似度

圖1 15批半夏厚樸湯物質(zhì)基準UPLC特征圖譜

2.2.7共有峰歸屬及指認 根據(jù)15 批物質(zhì)基準特征圖譜，共標定了12個共有峰（圖1）。通過與對照品比對，指認出峰2為咖啡酸、峰8為野黃芩苷、峰9為迷迭香酸、峰10為6-姜辣素、峰11為和厚樸酚、峰12 為厚樸酚。經(jīng)指認，峰1 來自姜半夏，峰2、5～9 來自紫蘇葉，峰3～4、11～12 來自姜厚樸，峰10來自生姜（圖2）。

圖2 半夏厚樸湯物質(zhì)基準、陰性樣品、單味飲片、對照品UPLC特征圖譜

2.2.8特征圖譜分析

2.2.8.1聚類分析（CA）將15 批樣品特征圖譜的12 個共有峰峰面積處理成量化特征峰數(shù)據(jù)，采用SIMCA 13.0 軟件進行CA。結(jié)果顯示，15 批樣品分為2 類，S3～S6、S8、S14 聚為一類，S1、S2、S7、S9～S13、S15 聚為一類，可能與不同產(chǎn)地飲片之間的配伍有關，其中S3～S6、S8、S14主要由山西運城的姜半夏、四川綿陽的姜厚樸、湖南湘潭的紫蘇葉配伍組成。

2.2.8.2主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 軟件對15批樣品的12個共有峰進行降維因子PCA，提取相關性矩陣數(shù)據(jù)（表3）。結(jié)果顯示，15 批半夏厚樸湯物質(zhì)基準提取到了3個主成分。

表3 15批半夏厚樸湯樣品PCA矩陣

2.2.8.3正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）將15 批樣品的12 個共有峰峰面積導入SIMCA 13.0軟件進行OPLS-DA，選擇3個主成分，其模型關鍵參數(shù)：模型對X矩陣的解釋率（R2X）、模型對Y矩陣的解釋率（R2Y）、模型的預測能力（Q2）值分別為0.803、0.925、0.829，說明該模型具有較好的擬合能力及預測能力。OPLS-DA得分圖（圖3）中，15批樣本聚為2類，與CA結(jié)果一致。OPLS-DA載荷圖中，圓點距離原點越遠，表明色譜峰權(quán)重值越大，對樣本的影響越大，根據(jù)OPLS-DA載荷圖（圖4），F(xiàn)9、F8、F4距離原點較遠，為主要影響成分。模型中變量重要性投影（VIP）值圖（圖5）中，一般認為VIP值＞1的色譜峰對樣本的影響較大，為主要差異成分。綜合圖4～5，篩選出對樣本影響較大的4個色譜峰，按影響程度依次為F9＞F8＞F3＞F4，其中F3、F4經(jīng)質(zhì)譜也未解析出其成分。

圖3 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA得分圖

圖4 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA載荷圖

圖5 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA VIP值

2.3 含量測定

本研究綜合特征分析篩選出的對樣本影響較大的色譜峰及處方發(fā)揮藥效作用的有效成分，以野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚為指標成分，建立半夏厚樸湯物質(zhì)基準的含量測定方法。

2.3.1色譜條件 野黃芩苷采用Acclaim ?RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2）色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm），以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～17 min，15%A；17～18 min，15%～70%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為330 nm。迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚按2.2.1項下色譜條件測定。

2.3.2供試品溶液制備 按照2.2.2 項下方法制備半夏厚樸湯物質(zhì)基準供試品溶液。

2.3.3對照品溶液制備 取野黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成野黃芩苷質(zhì)量濃度為9 μg·mL-1的溶液，即得野黃芩苷對照品溶液。取對照品迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚適量，精密稱定，加50%甲醇制成迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為22、10、10 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.4線性關系考察 取野黃芩苷對照品溶液，按照2.3.1 項下色譜條件進樣，進樣體積分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 μL；取迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚混合對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣，進樣體積分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL，測定峰面積，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線（表4）。

表4 野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚線性關系

2.3.5精密度試驗 取同一半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，分別按2.3.1 及2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算供試品溶液中野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.6重復性試驗 平行制備6 份半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，分別按2.3.1及2.2.1項下色譜條件進樣，計算供試品溶液中野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚含量的RSD 均小于2.0%，表明各指標成分方法重復性良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗 取半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h 按2.2.1 項下色譜條件測定，計算供試品溶液中迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚48 h 峰面積的RSD；按2.3.1 項下色譜條件測定，計算供試品溶液中野黃芩苷24 h 峰面積的RSD，結(jié)果均小于2.0%，表明迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚在供試品溶液制備后48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，野黃芩苷在供試品溶液制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8加樣回收率試驗 取已知含量的半夏厚樸湯物質(zhì)基準凍干粉（S1）0.1 g，精密稱定，平行9份，分成3 組，依次精密加入野黃芩苷對照品溶液5、10、15 mL（加入比例分別為0.5∶1.0、1∶1、1.5∶1.0），再加入50%甲醇使加入的溶液體積為25 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析，計算供試品溶液中野黃芩苷的加樣回收率及RSD。加入迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚混合對照品，2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，計算供試品溶液中迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚的加樣回收率及RSD。野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚的回收率分別為95.08%、96.49%、98.87%、100.12%，RSD均小于3.0%，表明其含量測定方法準確性良好。

2.3.9專屬性試驗 取半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1）供試品溶液、缺紫蘇葉陰性樣品溶液按2.3.1項下色譜條件測定，得專屬性圖譜（圖6）。表明野黃芩苷專屬性良好。迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚專屬性見特征圖譜圖1。

圖6 野黃芩苷專屬性圖譜

2.4 15批半夏厚樸湯物質(zhì)基準量值傳遞分析

2.4.1含量測定 取15 批半夏厚樸湯物質(zhì)基準凍干粉，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，分別按2.3.1及2.2.1 項下色譜條件測定。按公式（1）計算野黃芩苷、迷迭香酸、和厚樸酚、厚樸酚轉(zhuǎn)移率（表5）。15 批半夏厚樸湯物質(zhì)基準中，厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分數(shù)為0.09%～0.40%，均值為0.24%；野黃芩苷質(zhì)量分數(shù)為0.13%～0.33%，均值為0.24%；迷迭香酸質(zhì)量分數(shù)為0.20%～0.74%，均值為0.43%。厚樸酚與和厚樸酚總量的轉(zhuǎn)移率為7.18%～18.96%，均值為11.69%；野黃芩苷轉(zhuǎn)移率為46.04%～88.30%，均值為62.77%；迷迭香酸轉(zhuǎn)移率為29.91%～72.94%，均值為51.06%。

表5 15批半夏厚樸湯物質(zhì)基準4個指標成分的質(zhì)量分數(shù)、轉(zhuǎn)移率、出膏率

由于飲片性狀、質(zhì)地不均，含量差異較大，其溶出率存在一定差別，致使15 批半夏厚樸湯厚樸酚、和厚樸酚總質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)移率范圍超出規(guī)定范圍；湖南省及湖北省厚樸絲細、質(zhì)地松軟、含量偏低，煎煮時溶出率高，其轉(zhuǎn)移率較高。野黃芩苷、迷迭香酸的轉(zhuǎn)移率基本在均值的70%～130%，其含量離散型數(shù)據(jù)可能與處方及飲片含量差異有關。

2.4.2出膏率 精密稱取半夏厚樸湯物質(zhì)基準（S1～S15）濃縮液各10 g，置于質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取出，置于干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量，按公式（2）計算出膏率。15 批半夏厚樸湯物質(zhì)基準出膏率為9.01%～15.83%，均值為12.88%，基本在均值的70%～130%，未出現(xiàn)相差較大離散數(shù)據(jù)。

3 討論

3.1 物質(zhì)基準工藝考察

本研究根據(jù)半夏厚樸湯物質(zhì)基準的制備煎煮終點質(zhì)量考察3 個不同產(chǎn)地復方飲片煎煮30、60、90、100、110、120 min的吸水量，繪制吸水量-時間曲線圖，發(fā)現(xiàn)復方飲片吸水量1 h后基本趨于穩(wěn)定，1 h左右的吸水量為82.1 mL。按公式（3）計算理論終點質(zhì)量。

半夏厚樸湯物質(zhì)基準的野黃芩苷、迷迭香酸、%厚樸酚、和厚樸酚4 個含量指標分為兩類，一類為紫蘇葉中的酚酸類及黃酮類成分，一類為姜厚樸中的脂溶性成分，而紫蘇葉屬于芳香類藥物，依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中規(guī)定解表類、清熱類、芳香類藥物不宜久煎?？疾飕F(xiàn)代煎煮法與古代煎煮法4 個指標成分的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果顯示，古法煎煮厚樸酚、和厚樸酚轉(zhuǎn)移率高于現(xiàn)代煎煮，現(xiàn)代煎煮野黃芩苷、迷迭香酸轉(zhuǎn)移率高于古法煎煮。古法煎煮時間長，有利于厚樸酚、和厚樸酚脂溶性成分的溶出，現(xiàn)代煎煮法煎煮時間短，有利于紫蘇葉中的野黃芩苷、迷迭香酸的保留，這與古法煎煮功率考察結(jié)果一致。以經(jīng)典名方“遵古”為前提，結(jié)合半夏厚樸湯的主要藥效成分及厚樸為臣藥、紫蘇葉為佐藥的因素，選用古法煎煮制備物質(zhì)基準。

3.2 野黃芩苷含量測定條件的優(yōu)化

野黃芩苷與其相鄰的木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的相對分子質(zhì)量相同，互為同分異構(gòu)體，對于兩者的分離較為困難。前期考察了不同色譜柱（HSS T3、ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD、Thermo 苯基柱、Poroshell 120 EC-C18、Thermo Syncronis C18、ZORBAX SB-C18RRHD、CORTECS T3）、不同流動相（甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-乙腈-磷酸水溶液）均很難使野黃芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷很好地分離。后續(xù)采用對苯環(huán)羥基有選擇性的色譜柱，如Polaris 5 NH2（250 nm）、Acclaim?RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2，100 nm）均可有效分離野黃芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷，考慮到長期使用Polaris 5 NH2，色譜柱中的氨基會脫落影響柱效，不宜使用。故野黃芩苷與木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的分離采用AcclaimTMRSLC PolarAdvantage Ⅱ（PA2）色譜柱。對比不同甲酸酸度（0.05%、0.10%、0.20%）、不同酸（磷酸、冰乙酸、甲酸），發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸水溶液對野黃芩苷的分離效果較好，確定野黃芩苷含量測定流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液。

半夏厚樸湯用藥精煉、組方嚴謹，具有行氣散結(jié)、降逆化痰功效，是治療“梅核氣”的經(jīng)典方劑。為保證經(jīng)典名方制劑質(zhì)量療效一致，需建立從藥材到飲片、中間體、制劑全過程的整體質(zhì)量控制，嚴格把控制備過程中的質(zhì)量情況。本研究采用特征圖譜、指標性成分含量測定、轉(zhuǎn)移率及出膏率相結(jié)合的模式，對經(jīng)典名方半夏厚樸湯基準的量值傳遞過程進行分析，初步建立了科學穩(wěn)定的質(zhì)量評價方法，可為后續(xù)研究及相關制劑的質(zhì)量控制提供參考。