鹿角藤莖葉化學(xué)成分研究

吳敏，魯建美，孫朋，賈慧珍，宋興震，許又凱*

1.中國科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；

2.中國科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園，云南 勐侖 666303

鹿角藤屬（ChonemorphaG.Don）是夾竹桃科花皮膠藤族的多年生粗壯藤本，全世界約20 種，分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)；我國有8 種，主要分布于西南和華南各省區(qū)。鹿角藤C.eriostylisPitard為粗壯木質(zhì)大藤本，主要產(chǎn)于云南、廣西和廣東，生于疏林山地及濕潤山谷中[1]。鹿角藤植株皮層、葉及果均含膠乳，可制一般日常橡膠制品；其花大色艷，也是一種重要的園林景觀植物[2]；老莖供藥用，具有通經(jīng)活絡(luò)、活血止痛、接骨生肌、降壓等功效，主治腎虧腰痛、高血壓、風(fēng)濕性腰腿痛、跌打損傷，在廣西民間有治婦女黃疸的用途。

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，鹿角藤屬植物中的主要化學(xué)成分為甾體[3]、甾體糖苷[4]、甾體生物堿[5]、木脂素[6]、酚酸等。現(xiàn)代藥理研究表明，鹿角藤的乙醇粗提物具有抗菌[7]、抗氧化和降血糖[8]等生物活性。本研究對鹿角藤95%乙醇提取物進(jìn)行分離與鑒定，從中得到7個化合物，鑒定為1個木脂素類化合物（+）-丁香脂素（1），2 個香豆素類化合物異東莨菪內(nèi)酯（2）、東莨菪內(nèi)酯（3），1 個甾體類化合物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（4），3個甾體生物堿類化合物絲膠樹堿C（5）、清香桂堿D（6）、鹿角藤堿（7）。各化合物結(jié)構(gòu)式見圖1，其中，化合物2、4～6 為首次在該屬植物中分離得到。

圖1 鹿角藤中分離得到的化合物1～7的結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 試藥

樣品采自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，由西雙版納熱帶植物園肖春芬高級工程師鑒定為鹿角藤Chonemorpha eriostylisPitard的地上部分，標(biāo)本存于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園標(biāo)本館（標(biāo)本號：HITBC-0022506）。

維生素C（VC，分析純，批號：A15613，天津市祥瑞鑫化工科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑（美國Sigma 公司）；薄層色譜（TLC）和柱色譜所用試劑石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、無水乙醇、丙酮等均為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑公司）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；TLC 板（青島海洋化工廠）；反相硅膠RP-18（美國Merck公司）；中壓色譜分離凝膠（MCI，粒徑75～150 μm，日本三菱化學(xué)株式會社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（粒徑40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司）。

1.2 儀器

DRX-500、600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；QSTAR Pulsari 型串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國API 公司）；1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ODS-A 型色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

干燥的鹿角藤莖葉地上部分7 kg，粉碎后用95%乙醇（30 L×3 次）冷浸提取，每次3 d。提取液濾過，減壓蒸干溶劑得粗浸膏，用石油醚和乙酸乙酯分別萃取，得到粗浸膏87 g，再將其加到MCI 樹脂中，用梯度甲醇溶液（30%、60%、90%）洗脫，將90%甲醇洗脫組分蒸干，得45 g 殘留物，用硅膠拌樣，再經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，用二氯甲烷-甲醇（1∶0→0∶1）梯度洗脫，經(jīng)TLC 檢測后將類似組分進(jìn)行合并，共得到11個組分（A～K）。

將B 組分進(jìn)行硅膠色譜柱分離，凝膠色譜柱純化，最后再經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）分離得化合物2（5 mg）和3（5 mg）；將C 組分進(jìn)行硅膠色譜柱分離，再用凝膠柱色譜分離，最后用HPLC 純化，得到化合物1（5 mg）和4（5 mg）；將F組分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，然后再用制備板制備分離，用碘化鉍鉀顯示條帶的位置，刮下相應(yīng)位置，甲醇洗脫，得無色結(jié)晶化合物5（15 mg）；將D 組分重新用MCI柱分離，30%甲醇洗脫，再用硅膠柱色譜分離、凝膠柱色譜純化，得化合物6（10 mg）和7（10 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，電噴霧離子源（ESI）-質(zhì)譜法（MS）給出準(zhǔn)分子離子峰m/z419[M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C22H26O8；核磁共振氫譜（1H-NMR）(600 MHz,CD3OD)δ: 6.65 (4H,s,H-2′,6′,2″,6″),4.71(2H,d,J=4.2 Hz,H-4′,4″-OH),4.26 (2H,dd,J=9.0,6.8 Hz,H-4a,8a),3.87 (2H,dd,J=9.1,3.4 Hz,H-4b,8b),3.84(12H,s,3′,5′,3″,5″-OCH3),3.15(2H,t,J=5.5 Hz,H-1,5)；核磁共振碳譜（13C-NMR）(150 MHz,CD3OD)δ: 149.5 (s,C-3′,5′,3″,5″),136.7(s,C-4′,4″),132.7 (s,C-1′,1″),104.6 (d,C-2′,6′,2″,6″),87.7 (d,C-2,6),72.8 (t,C-4,8),56.8 (q,C-3′,5′,3″,5″-OCH3),55.5(d,C-1,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[9]，鑒定化合物1為(+)-丁香脂素。

化合物2：橙黃色結(jié)晶（甲醇），ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z193 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C10H8O4；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 7.81 (1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.96 (1H,s,H-8),6.96 (1H,s,H-5),6.24 (1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.95 (3H,s,7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 164.1 (s,C-2),153.7(s,C-6),150.2 (s,C-8a),145.9 (s,C-7),145.9 (d,C-4),113.5 (s,C-4a),113.4 (d,C-3),112.9 (d,C-8),100.5(d,C-7),56.8(q,7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[10]，鑒定化合物2為異東莨菪內(nèi)酯。

化合物3：橙黃色結(jié)晶（甲醇），ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z193 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C10H8O4；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 7.82 (1H,d,J=9.3 Hz,H-4),7.00 (1H,s,H-8),6.66 (1H,s,H-5),6.08 (1H,d,J=9.3 Hz,H-3),3.87 (3H,s,6-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 164.9 (s,C-2),152.5(s,C-7),148.8 (s,C-6),146.5 (d,C-4),110.8 (s,C-4a),109.9 (s,C-3),109.1 (s,C-5),104.3 (d,C-8),56.5 (q,6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[11]，鑒定化合物3為東莨菪內(nèi)酯。

化合物4：白色無定形粉末，ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z285 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C19H24O2；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.30 (1H,d,J=10.1 Hz,H-1),6.22 (1H,dd,J=10.1,1.9 Hz,H-2),6.09 (1H,t,J=1.5 Hz,H-4),2.63 (1H,tdd,J=13.5,5.2,1.3 Hz,H-6),2.08(1H,dd,J=19.3,9.2 Hz,H-7),1.67 (1H,tt,J=12.5,9.1 Hz,H-7) 1.32 (3H,s,18-CH3),0.97 (3H,s,19-CH3)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 222.9 (s,C-17),188.6 (s,C-3),173.1 (s,C-5),159.2 (d,C-1),127.7 (d,C-2),124.2 (d,C-4),54.1 (d,C-9),51.6 (d,C-14),45.3 (s,C-10),36.5 (t,C-16),36.2 (d,C-8),33.7 (t,C-6),33.7 (t,C-12),32.5 (t,C-7),23.3 (t,C-11),22.8 (t,C-15),19.1 (q,C-19),14.2 (q,C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[12]，鑒定化合物4為雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。

化合物5：無色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z346 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C23H39NO；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 2.37 (1H,t,J=14.4 Hz,H-2),2.22(1H,ddt,J=15.4,4.7,2.2 Hz,H-3),2.16 [6H,s,-N(CH3)2],2.06 (1H,ddt,J=8.2,3.9,2.0 Hz,H-8),2.01(1H,ddd,J=15.0,3.8,2.4 Hz,H-17),1.74 (1H,dq,J=12.9,3.5 Hz,H-20),1.06 (3H,s,19-CH3),0.94 (3H,d,J=6.5 Hz,21-CH3),0.72 (3H,s,18-CH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 214.8 (s,C-3),62.8 (d,C-20),57.7 (d,C-5),56.0 (d,C-17),55.2(d,C-9),48.2(d,C-14),45.5(t,C-4),43.1(s,C-13),41.0 (t,C-12),40.1 (q,N-CH3),40.1 (q,N-CH3),39.8(t C-16),38.9(t,C-1),36.8(s,C-10),36.7(d,C-8),32.9 (t,C-11),30.1 (t,C-2),28.6 (t,C-15),25.1(t,C-6),22.5 (t,C-7),12.6 (q,C-18),11.7 (q,C-19),10.5 (q,C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[13]，鑒定化合物5為絲膠樹堿C。

化合物6：無色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z348 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C23H41NO；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 3.59 (1H,tt,J=11.1,4.8 Hz,H-3),2.42(1H,dq,J=10.5,6.4 Hz,H-20),2.16 [6H,s,-N(CH3)2],1.91～1.83 (1H,m),0.86 (3H,d,J=6.4 Hz,CH3-21),0.80 (3H,s,CH3-19),0.64 (3H,s,CH3-18)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:71.5 (d,C-3),61.3 (d,C-20),56.8 (d,C-14),55.0 (d,C-17),54.5 (d,C-9),45.0 (d,C-5),41.9 (s,C-13),40.0 [q,-N(CH3)2],40.0 [q,-N(CH3)2],39.9 (t,C-12),38.4 (t,C-4),37.2 (t,C-1),35.6 (d,C-8),35.5 (s,C-10),32.2 (t,C-7),31.7 (t,C-2),28.9 (t,C-6),27.8 (t,C-16),24.2 (t,C-15),21.4 (t,C-11),12.5 (q,C-18),12.5(q,C-19),10.0(q,C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[14]，鑒定化合物6為清香桂堿D。

化合物7：磚紅色無定形粉末，ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z347 [M+H]+，相當(dāng)于分子組成為C23H42NO；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 3.35 (1H,m,H-20),3.09 (1H,dtd,J=12.2,7.7,3.8 Hz,H-3),1.90 (1H,m,H-16),1.85 (1H,m,H-4),1.82 (1H,m,H-6),1.69(1H,d,J=10.9 Hz,H-17),1.54(1H,dd,J=10.3,6.4 Hz,H-16),1.44 (J=17.2,9.1,7.2,4.1 Hz,H-8),1.33 (3H,d,J=6.6 Hz,H-21),1.21 (1H,m,H-5),1.20 (1H,m,H-14),1.10 (1H,td,J=13.6,13.0,3.9 Hz,H-6),0.88 (3H,s,H-19),0.77 (3H,s,H-18),0.75 (1H,d,J=4.9 Hz,H-9)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 67.0 (d,C-20),57.2 (d,C-14),55.1 (d,C-9),53.2 (d,C-17),51.7 (d,C-3),46.0 (d,C-5),44.2(d,C-13),40.4 (t,C-12),37.7 (t,C-6),36.6 (d,C-8),36.4(s,C-10),33.9(t,C-2),32.9(t,C-11),29.4(t,C-11),27.5 (t,C-4),26.9 (t,C-16),25.2 (t,C-15),22.1(t,C-7),12.5 (q,C-18),12.4 (q,C-19),12.0 (q,C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[15]，鑒定化合物7 為鹿角藤堿。

2.3 DPPH自由基清除活性檢測

用無水乙醇將待測樣品和DPPH 粉末分別配成100 μmol·L-1的溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。?6 孔板內(nèi)分別加入DPPH 溶液100 μL 與待測樣品液100 μL 混勻，在室溫避光反應(yīng)30 min 后，在酶標(biāo)儀的517 nm 波長下測吸光度（A）。以常用抗氧化劑VC（20.00～1.25 μg·mL-1）為陽性對照[半數(shù)抑制濃 度（IC50）值為2.37 μg·L-1]，以加DPPH 溶 液100 μL 與無水乙醇100 μL 組為空白對照。每個樣品平行測定3 次，取平均值。按公式（1）計算清除率[16]。對清除率＞50%的樣品分別測試其在200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μmol·L-1的清除率，利用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett′s多重比較檢驗分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用回歸分析的方法計算IC50值。

式中，A1為待測液+DPPH 的吸光度；A2為待測液+無水乙醇的吸光度；A3為DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度。

用DPPH 自由基清除法初篩結(jié)果表明，在化合物1～7 的濃度為100.0 μmol·L-1時，其DPPH 自由基清除率分別為86.7%、21.6%、15.5%、6.0%、6.5%、8.2%、11.2%。其中化合物1 表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，遂將其進(jìn)行復(fù)篩，測得其IC50值為33.1 μmol·L-1。

3 討論

本研究從鹿角藤莖葉的95%乙醇提取物中分離得到7 個化合物，其中化合物2、4～6 為首次在鹿角藤屬植物中分離得到，豐富了鹿角藤屬化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)多樣性，為其藥理活性研究提供參考。