基于活細胞及其衍生物的藥物遞送系統(tǒng)研究進展

張 蒙，黃容琴

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

1 前 言

納米顆粒已被廣泛用于提高藥物的治療效果，然而大量研究證明，納米顆粒對生物體具有毒性作用[1, 2]。此外，藥物遞送過程中的生物屏障阻止了納米藥物載體在病灶部位的累積，從而限制了藥物治療的效果。據(jù)報道[3]，到達腫瘤的納米藥物通常是靜脈注射劑量的1%，大多數(shù)納米藥物通過非特異性攝入而沉積在肝臟和脾臟中，從而引起副作用。因此，納米顆粒在臨床轉(zhuǎn)化中面臨許多挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)激發(fā)了研究者對新型藥物遞送載體的探索。

細胞具有感知、整合和響應(yīng)體內(nèi)動態(tài)環(huán)境的自然能力，可以作為治療藥物的載體。最近的相關(guān)研究主要集中在利用天然細胞或細胞來源的衍生物作為藥物載體，包括整個細胞、細胞外囊泡和外泌體等。在體內(nèi)注射游離蛋白質(zhì)和治療藥物之后通常會引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，從而使之在血液中被迅速清除[4]。而使用活細胞作為藥物載體，藥物被包裹在細胞內(nèi)或附著在細胞表面，隨后通過體液運輸?shù)讲≡畈课弧＜毎膬?nèi)包封可以改善藥物的藥代動力學(xué)特征，或顯著增加藥物對病理條件區(qū)域的靶向性[5]。同時，細胞及其衍生物能夠逃離機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，使其負載的藥物能夠在體內(nèi)持續(xù)存在，從而達到比天然或合成藥物更好的預(yù)期效果[6, 7]。綜上，由于活細胞及其衍生物具有較好的生物相容性、天然的靶向組織能力、固有的生物降解性、較高的載藥能力和天然的跨越生物屏障能力，利用活細胞及其衍生物進行藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計已經(jīng)成為藥物遞送領(lǐng)域的熱點研究方向。

2 基于活細胞的藥物遞送系統(tǒng)

人體含有多種具有不同生理功能的細胞，在保留細胞結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的高效遞送，是研究人員不斷探索的方向。近年來，細胞藥物載體如免疫細胞、無核細胞(紅細胞和血小板)、干細胞和細菌等已成為研究的熱點。本節(jié)總結(jié)了不同活細胞作為藥物分子和生物活性蛋白遞送載體的研究進展，并討論了它們的優(yōu)缺點。

2.1 免疫細胞

免疫細胞作為參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞群，在人體免疫中擔任著重要的角色。免疫細胞在接收到來自損傷組織的信號后遷移到感染組織處，可以有效抵御病原體。此外，免疫細胞自身不會引起不良的免疫反應(yīng)，具有優(yōu)越的生物相容性，與正常細胞的相互作用小，可以主動靶向特定細胞和位點[8, 9]。因此，免疫細胞是有潛力的藥物遞送載體。

2.1.1 巨噬細胞

巨噬細胞是人體吞噬細胞的一種，主要由白細胞產(chǎn)生，主要作用是清除損傷部位的外來碎片和細胞。由于巨噬細胞具有穿過血腦屏障和自然歸巢的能力[10]，因而在靶向和治療神經(jīng)退行性疾病、炎癥和癌癥等疾病方面具有顯著優(yōu)勢[11]。盡管如此，巨噬細胞作為遞藥載體仍然存在不足，比如巨噬細胞是活細胞，大量的藥物或納米顆粒中的藥物可能會干擾細胞的存活、遷移和功能，從而限制了藥物的負荷量。此外，巨噬細胞具有吞噬作用，該過程會釋放酶和酸來殺死和消化病原體[9]。在負載藥物之后，巨噬細胞會快速消化大多數(shù)藥物載體，降解藥物，從而降低藥物的釋放和療效。Dai等以巨噬細胞為模板，設(shè)計出功能化的“細胞機器人”，利用巨噬細胞的內(nèi)吞作用，將磁性納米粒子、阿霉素(DOX)和吲哚菁綠等組成的顆粒富集到細胞內(nèi)部，組成細胞機器人，以提高載藥效率，并且可以被外界磁場驅(qū)動。在外磁場和近紅外光(NIR)的作用下，該細胞機器人可以被精準控制到達靶向位置，釋放DOX，并在靶向位置對腫瘤進行殺傷[9]。

快速的精準靶向和多手段輔助的精準釋藥可以提高巨噬細胞載藥體系的治療效果。2021年，Nguyen等[12]開發(fā)了一種基于巨噬細胞的雙靶向的微型機器人，該微型機器人的構(gòu)建方法是將檸檬酸包被的超順磁性納米顆粒(CA-MNPs)和含DOX的熱敏納米脂質(zhì)體(DOX-TSLPs)共同負載到巨噬細胞中。將巨噬細胞本身的趨化性和外部磁場調(diào)節(jié)的磁靶向相結(jié)合，可以使之快速靶向到腫瘤部位。同時，磁性納米顆粒響應(yīng)NIR照射，觸發(fā)熱敏納米脂質(zhì)體釋放DOX，該系統(tǒng)實現(xiàn)了在腫瘤部位精確的時空控制藥物的釋放(圖1)。因此，以上基于巨噬細胞的多手段輔助的精準遞藥系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)化成優(yōu)良的臨床藥物輸送平臺，并在腫瘤靶向治療中發(fā)揮巨大的作用。

圖1 基于巨噬細胞的微型機器人抗癌治療原理示意圖[12]：(a)由脾細胞衍生的巨噬細胞負載到檸檬酸包被的超順磁性納米粒子(CA-MNP)和含DOX的熱敏納米脂質(zhì)體(DOX-TSLP)組成的微型機器人制備過程示意圖，(b)腫瘤細胞釋放的電磁場和化學(xué)梯度將微型機器人吸引到腫瘤部位，然后通過近紅外介導(dǎo)的藥物釋放破壞靶向的腫瘤細胞Fig.1 Schematic representation of the macrophages-based microrobot working principles as an antic ancer therapy[12]: (a) schematic diagrams of microrobots composed of splenocyte-derived macrophages loaded with superparamagnetic nanoparticles coated with citric acid (CA-MNPs) and DOX-containing thermosensitive nanoliposomes(DOX-TSLPs), (b) microrobots are attracted to the tumor site by an electromagnetic field and chemical gradients released by tumor cells, then the targeted tumor cells are destroyed by the NIR-mediated drug release

2.1.2 T細胞

T細胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分，可以特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答。同時，由于其較高的特異性，T細胞也是具有較高靶向性的一類細胞。當細胞毒性T細胞遇到其各自的抗原時，T細胞受體會使細胞表面還原電位增加，該信號使細胞分泌蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)抗原提呈細胞凋亡[13]。與抗原特異性結(jié)合后誘導(dǎo)細胞凋亡的這一過程，使T細胞在攜帶靶向藥物和消除腫瘤方面具有優(yōu)勢。例如，T細胞作為一種免疫細胞，具有直接殺傷靶細胞的生物學(xué)功能，因此T細胞能夠穿過血腦屏障并利用自身的細胞毒性殺死顱內(nèi)腫瘤[14]。此外，T細胞還能夠不受限制地接觸其他全身性疾病細胞，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)和癌癥(如黑色素瘤)，這使得T細胞作為生物載體具有獨特的優(yōu)勢[14-16]。

近年來，使用嵌合抗原受體(CAR)T細胞(CAR-T)的過繼性細胞療法顯示出強大的抗腫瘤免疫能力，首先將編碼這種CAR的基因?qū)攵拘訲細胞，然后經(jīng)過基因編輯的T細胞利用它們表達的CAR受體結(jié)合到靶細胞表面的分子，此種結(jié)合可觸發(fā)免疫系統(tǒng)的分子(如白細胞介素-15超激動劑(IL-15Sa)、B細胞)激活，產(chǎn)生促進組織損傷的抗體，從而實現(xiàn)靶細胞的快速摧毀。Tang等[17]

設(shè)計了“背包”納米凝膠，在腫瘤靶向T細胞膜上偶聯(lián)蛋白質(zhì)藥物，只有當CAR-T細胞與癌細胞結(jié)合并啟動T細胞表面氧化還原活性時，才會釋放蛋白質(zhì)藥物(圖2a)。研究發(fā)現(xiàn)，從納米凝膠中釋放的IL-15Sa蛋白質(zhì)藥物促進了T細胞的擴增(數(shù)量增加16倍)，從而加速腦膠質(zhì)瘤的抑制和清除。

作為臨床上的新型細胞療法，盡管CAR-T療法在癌癥的免疫治療中取得了成功，但一些挑戰(zhàn)仍然限制了CAR-T細胞治療癌癥的療效，包括脫靶毒性、抗原丟失和異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境免疫抑制、T細胞浸潤和滲透不足等[16]。CAR-T細胞介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷主要是通過誘導(dǎo)靶細胞的凋亡來實現(xiàn)。以黑色素瘤為例，黑色素瘤細胞中具有高水平的抗凋亡蛋白，因此誘導(dǎo)細胞凋亡是極其困難的。已經(jīng)有研究表明，黑色素瘤細胞的凋亡失敗(即凋亡失敗后存活的黑色素瘤細胞)會導(dǎo)致細胞粘附、趨化性增強，增加了黑色素瘤的遷移和侵襲[18]。因此，在遞藥系統(tǒng)設(shè)計時，使用CAR-T細胞和靶向抗凋亡信號通路的藥物聯(lián)合治療也可能是一個有用的解決方案。

2.1.3 中性粒細胞

中性粒細胞是人體含量最豐富的白細胞(占外周血循環(huán)中總白細胞的50%～70%)，是感染和腫瘤發(fā)生期間炎癥部位招募的主要細胞類型，這也說明了中性粒細胞可能可以用于炎癥和癌癥的納米治療[19, 20]。以中性粒細胞為基礎(chǔ)的給藥系統(tǒng)有望克服納米治療諸如生物相容性低、循環(huán)時間短和納米材料的免疫原性等局限性，在癌癥治療方面顯示出巨大的潛力。

腫瘤的發(fā)生過程總是伴隨著炎癥，藥物搭載中性粒細胞的“便車”可以自然地實現(xiàn)在腫瘤處的蓄積。Chu等發(fā)現(xiàn)，白蛋白納米?？梢栽谥行粤＜毎?即血液循環(huán)期間)搭“便車”，將治療藥物帶到腫瘤病灶區(qū)[21]。黑色素瘤gp75抗原的單克隆抗體TA99可以啟動腫瘤中性粒細胞的募集，因此中性粒細胞可以介導(dǎo)與TA99抗體共注射的白蛋白納米粒在腫瘤處的累積。他們進一步制備了光敏劑(焦脫鎂葉綠酸-a)負載白蛋白納米粒和TA99(TA99/Ppa BSA NPs)，與使用白蛋白納米?；騎A99治療相比，同樣在660 nm激光照射下，TA99/Ppa BSA NPs顯著抑制了腫瘤的生長并提高了小鼠存活率。這項研究提出了一種治療癌癥的新途徑，即通過納米?！按钴嚒泵庖呦到y(tǒng)來增強治療藥物向腫瘤部位的輸送。

此外，中性粒細胞具有穿越血腦屏障并穿透膠質(zhì)瘤部位的天然能力[22]。Zhang等將攜帶含有紫杉醇(paclitaxel, PTX)的脂質(zhì)體(PTX-CL)裝載到中性粒細胞(neutrophils, NEs)中(PTX-CL/NEs)[23]，在小鼠腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)試驗中，腫瘤切除后釋放的炎癥因子引導(dǎo)載藥的中性粒細胞進入發(fā)炎的大腦(圖2b)。大腦中高度集中的炎癥信號觸發(fā)PTX-CL從中性粒細胞中釋放，從而將PTX輸送到侵襲細胞中。這種中性粒細胞介導(dǎo)的藥物遞送有效減緩了腫瘤的復(fù)發(fā)生長，顯著提高了小鼠的生存率。在中性粒細胞中引入功能性納米藥物可能是改善復(fù)雜條件下納米治療的一種有前景的策略。

圖2 蛋白質(zhì)納米凝膠合成以及CAR-T細胞響應(yīng)局部微環(huán)境釋放蛋白質(zhì)的示意圖(a)[17]；中性粒細胞介導(dǎo)的抗癌藥物遞送抑制膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的方案設(shè)計，PTX-CL/NEs制備示意圖和PTX-CL/NEs抑制小鼠術(shù)后膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的示意圖(b)[23]Fig.2 Scheme forprotein nanogels synthesis and for release of protein in response to reduce activity in the local microenvironment (a)[17]; schematic design of neutrophil-mediated anticancer drug delivery for the suppression of postoperative glioma recurrence， the preparation of PTX-CL/NEs and the schematic shows how PTX-CL/NEs suppress postoperative glioma recurrence in mice (b)[23]

2.2 無核細胞

紅細胞和血小板由造血干細胞產(chǎn)生，是血液循環(huán)系統(tǒng)的獨特組成部分，因為它們沒有細胞核和遺傳信息，因此沒有異常生長或致瘤轉(zhuǎn)化的固有風險。相較于向體內(nèi)注射游離蛋白質(zhì)會引起快速的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)從血液中被快速清除，紅細胞和血小板可以在血液中不受阻礙地循環(huán)幾天，在藥物遞送方面具有顯著優(yōu)勢?？梢酝ㄟ^將治療分子裝在細胞內(nèi)(細胞內(nèi)包裹)或附著到細胞表面(表面修飾)來實現(xiàn)藥物遞送。

2.2.1 紅細胞

紅細胞也被稱為紅血球，是人體內(nèi)數(shù)量最多的血細胞類型，具有良好的生物相容性、可調(diào)的負荷能力和較長的血液循環(huán)半衰期(人類紅細胞的半衰期約為120 d)。紅細胞具有完全的生物降解性，沒有任何毒性副產(chǎn)物，在使用紅細胞負載藥物時，在循環(huán)遞送過程中可以使生物體免受毒副作用。紅細胞除了具有雙凹形狀和較高的表面積之外，還不具有細胞核和許多細胞器，這些獨特的性質(zhì)為細胞的藥物裝載和表面改性提供了足夠的空間。一些納米顆粒在肝臟、脾臟的積蓄，可能會對機體產(chǎn)生長期毒性，這限制了其臨床轉(zhuǎn)化進程。近期有研究表明，將納米藥物顆粒負載在紅細胞中，可以減少許多單核吞噬系統(tǒng)器官(如肝和脾)對納米顆粒的攝取[24]。并且，表達于紅細胞表面的CD47蛋白質(zhì)可以向免疫系統(tǒng)發(fā)出信號，以避免紅細胞被巨噬細胞攝取[25]，便于藥物裝載到紅細胞表面或其內(nèi)部。此外，CD47還具有延長藥物在血液中循環(huán)時間的作用[26]。

細胞內(nèi)的藥物負載可以為藥物的封裝提供一個免疫特權(quán)環(huán)境，從而增加其循環(huán)時間。實現(xiàn)細胞內(nèi)包封的一種方法是將紅細胞置于低滲溶液中，誘導(dǎo)細胞膜上的孔洞(尺寸15～100 nm)暫時性地打開，這樣藥物分子就可以進入細胞，當切換到等滲環(huán)境，這些孔洞就會關(guān)閉，從而將藥物分子包裹在細胞內(nèi)[27]。利用該方法，Dumont等成功地將抗炎和免疫抑制的前藥分子(地塞米松的前藥地塞米松磷酸鈉)包裹在紅細胞內(nèi)，實現(xiàn)了炎癥性腸病囊性纖維化和共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥的臨床治療[27]。

此外，藥物也可以搭載紅細胞的“便車”到達靶部位，即在紅細胞外部連接大分子藥物。為了將“紅細胞便車”靶向特定的器官，Brenner等將納米載體(脂質(zhì)體或白蛋白)在體外吸附到紅細胞(red blood cell, RBC)上(RBC-NPs)[28]，向小鼠的動脈(intra-arterially, IA)內(nèi)注射RBC-NPs，使藥物在下游器官中積累，以治療心臟病發(fā)作和中風(圖3a)。通過IA注射，這種新型藥物運輸方式使得藥物在大腦、腎臟和外周組織中有較高的累積。

2.2.2 血小板

血小板是一種體積較小的無核循環(huán)細胞，直徑約1～3 μm[29]，單個血小板的壽命約為8～10 d，因此，骨髓造血組織中的巨核細胞持續(xù)產(chǎn)生大量新的血小板以維持正常的血小板數(shù)目。血小板的快速補充特性和適當?shù)难h(huán)時間，避免了體內(nèi)長時間的蓄積，因而成為可再生和高安全性的用于細胞治療的理想藥物載體。近年來相關(guān)研究表明，血小板的數(shù)量和活性增加與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān),其主要通過促進腫瘤細胞的免疫逃避、黏附作用以及血管生成參與腫瘤轉(zhuǎn)移進程。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞分泌的前列腺素E2(PGE2)可激活血小板進而釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，促進腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而促進腫瘤細胞的存活和轉(zhuǎn)移[30]。此外，血小板進入血液循環(huán)后的聚集還可以保護循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)免受自然殺傷細胞的免疫監(jiān)視，并通過增強與內(nèi)皮細胞的粘附，使CTCs滲出血管。因此，利用血小板靶向系統(tǒng)進行抗腫瘤治療，可能具有更好的治療效果[31]。

近期，King等開發(fā)了一種血小板介導(dǎo)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducedligand, TRAIL，一種選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的蛋白)的遞送系統(tǒng)[32]。他們將TRAIL和血管性血友病因子A1結(jié)構(gòu)域(vWF-A1)同時修飾到納米脂質(zhì)體表面，因為vWF-A1可以與血小板受體復(fù)合物GPIb-IX-V結(jié)合，從而使該藥物修飾的納米脂質(zhì)體搭載血小板的“便車”實現(xiàn)CTCs的靶向，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在各種原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥臨床樣本中，血小板介導(dǎo)的TRAIL遞送系統(tǒng)殺死了血液中超過60%的CTCs。血小板-脂質(zhì)體治療是一種很有前景的方法，可與手術(shù)聯(lián)合使用來預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

血小板活化會引起自身劇烈的形態(tài)變化，并導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的釋放。新型藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計主要是基于血小板粘附于腫瘤細胞和將藥物遞送到靶向的惡性細胞的能力。例如，Xu等[33]將DOX裝載進入天然血小板中用于治療淋巴瘤。將DOX包載于血小板中，此過程并未顯著誘導(dǎo)血小板形態(tài)學(xué)和功能的改變。DOX-血小板通過“腫瘤細胞誘導(dǎo)的血小板聚集”促進細胞內(nèi)藥物積累，并以pH響應(yīng)的方式將DOX釋放到培養(yǎng)基中。同時，將DOX放入血小板中可以消除DOX游離在機體內(nèi)環(huán)境中所產(chǎn)生的有害影響(循環(huán)時間差和心臟毒性作用等)，并且增強對淋巴瘤細胞的生長抑制作用(圖3b)。DOX-血小板通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因的表達來提高DOX的抗腫瘤活性，因此血小板可以作為淋巴瘤臨床治療的潛在藥物載體。

圖3 納米載體在體外吸附到紅細胞上，血管內(nèi)導(dǎo)管注射后轉(zhuǎn)移到下游毛細血管(a)[28]；DOX-血小板在體外和體內(nèi)增強抗腫瘤活性的機制示意圖(b)[33]Fig.3 Nanocarriers are adsorbed onto the RBCs ex vivo, and then transfer to downstream capillaries after intravascular catheter injection (a)[28]; schematic illustration of the possible mechanism of enhanced anti-tumor activity of DOX-platelet in vitro and in vivo (b)[33]

2.3 干細胞

干細胞是一種未分化的細胞，具有產(chǎn)生不同類型細胞的潛力，由于具有在癌組織中生存和耐受的能力，將其作為化療藥物載體的相關(guān)研究受到研究人員的關(guān)注。因為是活細胞，干細胞具有生物可降解性和生物相容性[34]，同時還具有再生、免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性[34,35]。此外，干細胞能夠基于趨化信號靶向特定的細胞，并浸潤特定的腫瘤類型。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能干細胞，具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在特定的體外刺激下具有克隆性擴增能力，能夠分化為骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。常用的骨髓間充質(zhì)干細胞類型為骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪來源的骨髓間充質(zhì)干細胞。MSCs易于從各種組織中分離并且易于在體外擴增，因而成為提供特異性并靶向癌癥治療的有競爭力的候選者。

MSCs具有腫瘤歸巢能力，在全身注射后可聚集在腫瘤病灶區(qū)內(nèi)，可以作為腫瘤靶向治療的藥物載體。近期，Takayama等利用親和素-生物素復(fù)合的方法[36]，將負載DOX的脂質(zhì)體(DOX-Lips)成功修飾到了MSCs的表面，此過程沒有改變MSCs的細胞特性。動物實驗結(jié)果也顯示，尾靜脈注射DOX-Lips修飾的MSCs 1 h后，藥物在小鼠腫瘤處的蓄積明顯高于其他組織，同時，該遞藥系統(tǒng)可以顯著抑制皮下荷瘤小鼠和肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中的腫瘤生長。

影響細胞給藥有效性的一個關(guān)鍵參數(shù)是有效載荷能力，除了采用細胞表面共價連接的方式進行藥物的負載，MSCs同樣也可以進行內(nèi)部載藥。但是，當依賴于干細胞的非特異性內(nèi)吞作用時[37]，細胞的快速循環(huán)和胞吐作用會導(dǎo)致較低的納米顆粒負載能力。同樣，細胞不斷地內(nèi)化和循環(huán)其外膜，可能導(dǎo)致膜偶聯(lián)納米顆粒的溶酶體降解。Moku等在納米顆粒表面修飾穿膜肽，以增強骨髓間充質(zhì)干細胞的藥物有效載荷能力[38]。穿膜肽通常為5～30個氨基酸組成，其特征是賦予納米顆粒通過大胞吞[39]進入細胞質(zhì)并繞過溶酶體的能力。在迄今為止發(fā)現(xiàn)的各種穿膜肽中，轉(zhuǎn)錄反激活因子(transactivator, TAT)肽已被廣泛研究，用以改善細胞內(nèi)各種裝載物的遞送。研究人員通過將TAT肽共價偶聯(lián)到封裝紫杉醇的納米顆粒表面，改善了MSCs對納米顆粒的內(nèi)化和保留，從而增強了有效載荷量。

2.4 細菌

細菌是由單個細胞構(gòu)成的，細菌的細胞內(nèi)具有細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)等結(jié)構(gòu)，但都沒有成形的細胞核，屬于原核細胞。人體內(nèi)居住著許多不同的微生物群，這些微生物分布于人體各處，包括腸道、口腔、皮膚、呼吸道等部位。某些細菌棲息在身體特定部位的生態(tài)位中，可以優(yōu)先靶向該部位并在腫瘤微環(huán)境中生存。因此，以細菌為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)是目前有吸引力的選擇。血液循環(huán)和其他正常組織中的細菌分別可以在數(shù)小時和數(shù)天內(nèi)被清除，而腫瘤中的細菌往往會持續(xù)增殖，數(shù)量往往遠遠超過最初使用的集落形成單位[40]。這種選擇性的定植很可能是與實體腫瘤相關(guān)的病理改變引起的免疫抑制和腫瘤部位獨特的生化微環(huán)境共同作用的結(jié)果。

血管結(jié)構(gòu)的缺陷、間質(zhì)壓力的升高和腫瘤微環(huán)境中滲透距離的增加是將治療藥物引入腫瘤的主要障礙。近年來，以細菌為遞藥載體的研究不斷發(fā)展。將載藥脂質(zhì)體通過化學(xué)偶聯(lián)附著在海洋趨磁細菌(MC-1)表面，將修飾后的MC-1注射到小鼠腫瘤附近，通過使用外部磁場，利用改造過的細菌的趨磁性將載藥細菌引導(dǎo)到腫瘤部位，然后關(guān)閉磁場，修飾后的MC-1優(yōu)先遷移到腫瘤深處，隨后向低氧區(qū)域移動。注射的MC-1(高達55%)能夠進入腫瘤的缺氧區(qū)域，表明這些改造后的趨磁細菌具有穿透實體腫瘤的能力[41]。此外，細菌也被用于將功能性核酸遞送到人類的實體腫瘤中。2007年，Akin等研究發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白(green fluorescent protei, GFP)報告基因、螢火蟲熒光素酶和分泌堿性磷酸酶均可以通過附著在細菌表面的納米顆粒中進行遞送[42]。腫瘤細胞吞噬細菌后，這些細菌將攜帶的DNA釋放到腫瘤細胞中，實現(xiàn)了基因在腫瘤細胞中的表達。利用細菌作為非病毒載體將基因遞送到腫瘤細胞中，為重新編程腫瘤細胞提供了可行性方案。

此外，以細菌為載體，聯(lián)合其它多種策略進行腫瘤治療的方案不斷被挖掘。聚多巴胺(pDA)是一種仿生光熱材料，具備良好的生物相容性與生物可降解性，光熱轉(zhuǎn)化效率較高。Chen等利用多巴胺在堿性溶液中的氧化自聚合反應(yīng)，使pDA成功地包裹于減毒沙門氏菌VNP20009(VNP)的表面(pDA-VNP)，構(gòu)建了細菌與光熱療法聯(lián)合的抗腫瘤治療方案[43]。如圖4所示，pDA-VNP經(jīng)尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)后，可以靶向?qū)嶓w腫瘤的缺氧區(qū)域，在近紅外激光照射下誘導(dǎo)腫瘤處的溫度升高。更重要的是，該研究發(fā)現(xiàn)VNP和pDA相互增強了治療能力，具有優(yōu)越的抗腫瘤效果。

圖4 pDA-VNP光熱療法產(chǎn)生的腫瘤細胞裂解進一步改善了細菌介導(dǎo)的生物治療[43]Fig.4 Tumor cell lysis generated by pDA-VNP-based photothermal therapy further improves bacteria-mediated biotherapy[43]

3 基于囊泡的藥物遞送系統(tǒng)

除了前文描述的基于細胞的藥物遞送策略外，囊泡作為細胞衍生的膜顆粒，能繼承源細胞的功能，如免疫逃逸、長循環(huán)和識別能力等。本節(jié)總結(jié)了細胞外囊泡和細菌外膜囊泡作為藥物分子和生物活性蛋白遞送載體的進展，并討論了其優(yōu)缺點。這種細胞衍生的囊泡被廣泛使用，有望成為新興的藥物遞送工具。

3.1 細胞外囊泡

細胞外囊泡是一種天然的納米載體，能攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖等生物活性分子，有助于細胞和組織之間信息的傳遞，從而在細胞通信中發(fā)揮重要作用。細胞外囊泡根據(jù)大小和形態(tài)可大致分為3種類型：凋亡小體(1000～5000 nm)、大囊泡或微粒(100～1000 nm)和外泌體(50～100 nm)[44]。其中，外泌體是研究最全面的囊泡。細胞外囊泡已被證明可以攜帶包括蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA在內(nèi)的功能活性生物分子，可以通過血液和淋巴管將信號傳遞到周圍環(huán)境中的目標細胞以及遠處的器官。

外泌體來源于晚期核內(nèi)體，是由細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質(zhì)中的膜性囊泡，是細胞外囊泡的最小形式。由于尺寸較小，單核吞噬細胞系統(tǒng)無法對其進行清除[45]，因此，外泌體可以作為藥物的“隱形外衣”。使用外泌體載藥克服了2種主要的干細胞并發(fā)癥，即致瘤性和移植物抗宿主病，同時保留了所有的靶向性和親本細胞類型的優(yōu)勢[46]。大多數(shù)類型的細胞，如樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)、上皮細胞、巨噬細胞、網(wǎng)織紅細胞、肥大細胞、血小板、神經(jīng)元、B細胞、T細胞、少突膠質(zhì)細胞、腫瘤細胞和雪旺細胞等均能釋放外泌體。外泌體的成分很大程度上取決于細胞的來源，例如，來自B淋巴細胞的外泌體具有功能性的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)I、II和T細胞共刺激分子，可以刺激T細胞增殖；癌細胞來源的外泌體含有明膠溶解酶和其他與細胞粘附相關(guān)的分子，可以促進腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[47]。外泌體作為一種內(nèi)源性多功能載體，具有獨特的“歸巢”效應(yīng)，即靶向產(chǎn)生外泌體的源細胞的能力。因此，外泌體在各種治療藥物的遞送方面具有巨大潛力。其中，對MSCs來源的外泌體、腫瘤細胞來源的外泌體和免疫細胞來源的外泌體的研究較為廣泛。

藥物分子可以通過主動或被動的方式加載/封裝到外泌體中。被動載藥法可以通過藥物與外泌體孵育或藥物與供體細胞孵育來實現(xiàn)，相對簡單和直接。主動載藥法可以通過超聲處理、擠壓、電穿孔或藥物偶聯(lián)等技術(shù)實現(xiàn)，載藥效率高，有利于大分子藥物的負載。DOX是一種廣泛使用的抗癌藥物，但將細胞長期暴露于DOX中會導(dǎo)致顯著的細胞毒性，限制了DOX的持續(xù)使用。Schindler等在研究中發(fā)現(xiàn)，與游離DOX和市售DOX脂質(zhì)體(Myocet?和Doxil?)相比，將DOX負載到外泌體中更容易被細胞攝取，DOX可以從核內(nèi)體分布到細胞核[48]。此外，Li等開發(fā)了一種用于靶向給藥的抗體功能化的外泌體，并對其體內(nèi)療效進行了評估。通過超離心法從A33陽性的結(jié)直腸癌(LIM1215)細胞中分離出外泌體，并進行了DOX的裝載。帶有A33抗體的超磁性氧化鐵納米顆粒(US)與A33陽性外泌體結(jié)合，形成了外泌體復(fù)合物(A33Ab-US-Exo/Dox)。小鼠體內(nèi)實驗表明，該復(fù)合物具有良好的腫瘤靶向能力和腫瘤抑制能力，可以延長小鼠存活時間和降低心臟毒性[49]。通過修飾抗體可提高外泌體復(fù)合物的腫瘤靶向能力，高密度抗體功能化的外泌體是一種有效的癌癥治療方法。

其他使用外泌體為遞送載體的藥物有用于治療胰腺癌的吉西他濱(Gem)和用于治療帕金森病的多巴胺。外泌體除了提高用藥效率外，還被用來攜帶小分子穿過血腦屏障。帕金森病是常見的神經(jīng)退行性疾病，受血腦屏障的阻礙，其治療具有挑戰(zhàn)性。有研究報道，負載有多巴胺的外泌體(0.2 mL, 相當于左旋多巴4.95 mg/kg)通過血液傳遞時，小鼠大腦中的多巴胺濃度為(1.02±0.15) nmol/g，而接受游離多巴胺的小鼠大腦中未檢測到多巴胺(串聯(lián)質(zhì)譜檢測限為0.065 nmol/g)。該研究表明，通過將多巴胺裝入外泌體，可以使其在腦中的分布增加15倍以上，而游離多巴胺傾向于在肝臟、肺和腎臟中積累。體外和體內(nèi)研究顯示，與單獨使用游離多巴胺相比，外泌體對帕金森病小鼠模型具有更好的治療效果，并具有更低的全身毒性[50]。

盡管外泌體展示出可跨越血腦屏障的能力，但許多研究表明，靜脈注射的外泌體主要分布在肝臟或脾臟，只有很小一部分保留在大腦或腫瘤部位[51]。MicroRNA-21(miR-21)是包括膠質(zhì)母細胞瘤在內(nèi)的實體腫瘤中上調(diào)最高的miRNA之一，下調(diào)miR-21可作為一種干預(yù)腫瘤細胞增殖和增加凋亡的方法。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在膠質(zhì)母細胞瘤表面過表達，而轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向肽T7是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，因此，可以通過T7肽靶向膠質(zhì)母細胞瘤。Kim等通過將T7作為T7和溶酶體相關(guān)膜蛋白2b(Lamp2b)的融合蛋白摻入到外泌體膜中，產(chǎn)生了裝飾有T7肽的外泌體(T7-exo)，并通過電穿孔將miR-21反義寡核苷酸裝載到外泌體中。研究表明，與未修飾的外泌體相比，通過尾靜脈注射，T7-exo可更有效地將miR-21反義寡核苷酸遞送至大腦，有效降低膠質(zhì)母細胞瘤中的miR-21水平[52]。因此，可以通過腫瘤靶向配體對外泌體進行修飾，提高其靶向遞送到大腦的效率[51]。

3.2 細菌外膜囊泡

細菌外膜囊泡(outermembrane vesicles, OMVs)是由微生物細胞表面產(chǎn)生的球形膜性囊泡，直徑在20～500 nm之間。不同細菌產(chǎn)生的囊泡不僅在大小、形態(tài)、組成和形成方式上不同，名稱也有所不同。由于OMVs來源于細菌的外表面，其保留了細菌外膜的基本特征，并包含蛋白質(zhì)、DNA、RNA、代謝物和毒素等[53]。細菌OMVs具有較大的載藥空間，可以像傳統(tǒng)的納米顆粒一樣作為納米載體，主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、甘油磷脂和包括周質(zhì)蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)。其中，LPS賦予細菌OMVs佐劑功能，可作為疫苗開發(fā)的抗原成分。例如，細菌OMVs可以通過電穿孔的方式裝載siRNA[54]，通過基因工程可實現(xiàn)卵清蛋白片段[55]和堿性成纖維細胞生長因子[56]在細菌OMVs表面的抗原呈遞。對于相對疏水和容易與親脂膜相互作用的小分子藥物，可以直接被動擴散到細菌OMVs內(nèi)部，實現(xiàn)藥物的裝載[57]。另一種裝載方法是在親代細菌菌株生長過程中將藥物裝載進OMVs。Allan等研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌PAO1菌株的生長過程中摻入慶大霉素后，可以產(chǎn)生含有慶大霉素的OMVs，從而將藥物裝載到目標細菌的OMVs中[57]。

作為一種藥物遞送工具，OMVs具有體積小、穩(wěn)定、耐受性良好和特異性高的優(yōu)點。與普通脂質(zhì)體容易循環(huán)降解導(dǎo)致藥物泄漏不同，OMVs具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，在懸浮液中不會分解，可以在特定的生理條件下緩慢釋放藥物，減少藥物泄漏到機體循環(huán)系統(tǒng)中引起的非特異性毒性。此外，這種慢釋放特性可以為siRNA在血供異常的區(qū)域提供足夠的時間到達靶細胞[54]。

4 結(jié) 語

基于活細胞及其衍生物的藥物遞送系統(tǒng)展示出了許多優(yōu)勢，特別是在生物相容性和靶向性等方面。目前，包括無機和聚合物納米顆粒在內(nèi)的大多數(shù)給藥系統(tǒng)，其本質(zhì)是外來材料，盡管其中一些已獲得臨床批準，但仍可能具有潛在的毒性和免疫原性。相較于納米載體，細胞及其衍生物是內(nèi)源性的，生物相容性好。然而，這些載體從實驗室向臨床應(yīng)用的過程，仍面臨一定的局限。

(1)細胞直接封裝游離藥物時，藥物毒性可能會影響細胞的活性，而且這些藥物較難以空間或時間上可控的方式釋放。

(2)有些細胞適合作為藥物載體，但存在數(shù)量少、壽命短等局限，不能滿足疾病治療對細胞的大量要求。細胞模擬物具有類似于細胞的人造結(jié)構(gòu)，它們能夠自主地攝取、處理和排出物質(zhì)，實現(xiàn)活細胞的基本功能。目前還沒有非常有效的方法產(chǎn)生活細胞或其相關(guān)的細胞模擬物，限制了這些細胞載體在臨床上的大規(guī)模使用。

(3)除了研究引入的細胞對機體的影響外，還需要保證細胞免受機體環(huán)境的影響，特別是免受免疫活性分子和免疫細胞的影響。針對這一問題，目前一種很有前景的方法是細胞微封裝技術(shù)，將工程細胞封閉在半透膜膠囊中。膠囊可以防止免疫細胞以及大分子抗體通過半透膜，同時允許氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入。除了保護工程細胞免受宿主的影響外，微膠囊化已經(jīng)成為一種很有前途的策略，可以實現(xiàn)數(shù)周或數(shù)月的長期給藥。

(4)活細胞在體內(nèi)的代謝、安全性、細胞內(nèi)的穩(wěn)定性、是否會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生以及保證工程治療細胞不干擾機體其它基本過程等方面都有待進一步探究。