蛋白酶靶向的熒光納米診療探針研究進(jìn)展

邢 潔，姚俊列,3，馬雪華,3，吳愛國(guó)

(1.中國(guó)科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所 寧波慈溪生物醫(yī)學(xué)工程研究所 浙江省生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)與應(yīng)用國(guó)際科技合作基地 中國(guó)科學(xué)院磁性材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)用植介入材料浙江省工程研究中心，浙江 寧波 315201) (2.先進(jìn)能源科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 惠州 516000) (3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1 前 言

蛋白酶對(duì)生命活動(dòng)代謝過(guò)程至關(guān)重要，其中特定酶的異常活性通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、癌癥、糖尿病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等[1]。因此，在體內(nèi)外對(duì)酶的活性進(jìn)行檢測(cè)和實(shí)時(shí)成像，可有助于了解生物學(xué)問題、揭示疾病進(jìn)程，從而促進(jìn)輔助藥物管理和藥物代謝研究[2-4]。相較于臨床使用的傳統(tǒng)成像診斷方式，熒光成像具有低侵入性、低輻射、低毒性、實(shí)時(shí)快速響應(yīng)和強(qiáng)大的空間成像能力等優(yōu)點(diǎn)?；诖?，許多蛋白酶響應(yīng)熒光探針被設(shè)計(jì)開發(fā)用于疾病診斷和治療[5]。

目前，臨床用熒光探針主要用于淺表癌癥早期診斷、腫瘤血管成像等，它可以區(qū)分病變組織和正常組織邊界，實(shí)現(xiàn)熒光引導(dǎo)的術(shù)中導(dǎo)航[6-8]。隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，各種納米熒光基團(tuán)如上轉(zhuǎn)換納米粒子、貴金屬納米簇、碳點(diǎn)、金屬化合物量子點(diǎn)和有機(jī)納米聚合物發(fā)光體在熒光探針設(shè)計(jì)中被頻繁使用[9-11]。同時(shí)，大量納米載體平臺(tái)如自組裝納米膠束、金屬有機(jī)骨架(metal organic frameworks, MOFs)等結(jié)構(gòu)對(duì)診療一體化納米探針的開發(fā)做出巨大貢獻(xiàn)[12]。近年來(lái)，基于光學(xué)介導(dǎo)的腫瘤消融治療一體化路線在熒光診療探針的功能設(shè)計(jì)中激增，例如光熱治療(photothermal therapy, PTT)、光動(dòng)力治療(photo dynamic therapy, PDT)、光化學(xué)治療(photochemotherapy, PCT)和光放射治療(photoradiotherapy, PRT)等治療方式[5]。

腫瘤相關(guān)蛋白酶在癌癥發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，開發(fā)癌癥相關(guān)異常表達(dá)蛋白酶響應(yīng)型熒光診療探針，采用熒光探針非侵入性地檢測(cè)、評(píng)估并利用其在體內(nèi)的活性對(duì)癌癥進(jìn)行診斷、治療及預(yù)后都具有重要意義[13, 14]。本文主要針對(duì)近5年基于基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶、半胱天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和一些其它類型蛋白酶(如成纖維細(xì)胞激活蛋白等)所構(gòu)建的熒光納米診療探針進(jìn)行綜述(圖1)，并討論目前蛋白酶熒光納米診療探針研究中存在的問題及改進(jìn)措施。

圖1 蛋白酶靶向的熒光納米診療探針研究進(jìn)展Fig.1 Research progress of protease targeted fluorescent theranostic nanoprobes

2 蛋白酶響應(yīng)熒光納米診療探針

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的重要生物標(biāo)志物[15, 16]。近年來(lái)，基于腫瘤微環(huán)境高表達(dá)MMPs的特性，研究人員設(shè)計(jì)了一系列熒光診療探針，主要是成像檢測(cè)和熒光響應(yīng)診療一體化探針，其中小分子熒光探針居多[17, 18]，納米探針相對(duì)較少[19, 20]。

MMP-2是MMPs家族中最重要的蛋白酶之一，其在大多數(shù)實(shí)體瘤中過(guò)度表達(dá)，因此MMP-2活性的分析對(duì)于癌癥的臨床診斷和治療評(píng)估具有重要意義[13]。Chan等[21]開發(fā)了一種熒光納米復(fù)合物診療探針，該探針由上轉(zhuǎn)換納米粒子、MMP-2識(shí)別多肽和淬滅劑3個(gè)主要部分組成，被MMP-2識(shí)別后會(huì)發(fā)射出熒光信號(hào)。首先，采用高溫共沉淀法制備了油酸配體保護(hù)的NaYF4∶Yb3+/Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)。接著在上轉(zhuǎn)換納米粒子表面包覆一層二氧化硅外殼，并進(jìn)一步通過(guò)羧基將MMP-2識(shí)別的多肽修飾在二氧化硅表面，金納米粒子作為淬滅劑通過(guò)巰基連接到多肽上，形成納米復(fù)合探針UCNP@p-Au。UCNP@ p-Au檢測(cè)MMP-2的原理是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)。探針上的MMP-2識(shí)別多肽被響應(yīng)前，內(nèi)部上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)射的熒光被金納米粒子吸收，探針呈現(xiàn)弱熒光狀態(tài)，而在腫瘤微環(huán)境中，多肽被MMP-2識(shí)別并斷裂，導(dǎo)致金納米粒子脫落, FRET效應(yīng)消失，上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光得以恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)響應(yīng)型熒光檢測(cè)診療應(yīng)用(圖2)。

圖2 MMP-2靶向探針UCNP@p-Au結(jié)構(gòu)和成像示意圖[21]Fig.2 MMP-2 targeted probe UCNP@p-Au structure and imaging diagram [21]

同樣基于FRET探針設(shè)計(jì)原理，Nguyen等[22]設(shè)計(jì)了具有MMP-9開啟熒光特性的金納米簇/石墨烯復(fù)合納米探針，用于檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞分泌的MMP-9。一步法合成由MMP-9響應(yīng)肽和巰基十一酸雙配體穩(wěn)定的熒光金納米簇，并通過(guò)金納米簇表面配體MMP-9響應(yīng)肽的自由端吸附連接到石墨烯上，形成金納米簇/石墨烯復(fù)合納米探針。在MMP-9肽連接情況下，金納米簇和石墨烯距離較近，由于FRET效應(yīng)，金納米簇?zé)晒獗皇┪?，而?dāng)探針在含有MMP-9的體系中被響應(yīng)發(fā)生肽鍵斷裂，金納米簇脫離石墨烯表面，其熒光恢復(fù)，即通過(guò)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)MMP-9的特異性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該金納米簇/石墨烯復(fù)合納米探針對(duì)MMP-9的檢測(cè)限可達(dá)0.15 nmol·L-1，具有高靈敏度、高選擇性和簡(jiǎn)便性，顯著縮短檢測(cè)時(shí)間、降低操作復(fù)雜度。

除了無(wú)機(jī)熒光納米探針，近年來(lái)有機(jī)熒光納米探針也被開發(fā)?；谀[瘤原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移區(qū)域高表達(dá)MMP-2和MMP-9的特點(diǎn)，Cho等[23]設(shè)計(jì)了雙發(fā)射熒光納米探針(dual-emissive fluorogenic nanoprobe, DFNP)，用于監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域MMP-2和MMP-9的活性。該探針結(jié)構(gòu)是通過(guò)自組裝形成，自組裝單體主要由染料Cy7標(biāo)記的嵌段聚合物F127(F127-Cy7)和無(wú)熒光疏水肽(Cy5.5MMP-Q)組成，其中Cy5.5MMP-Q對(duì)MMP-2和MMP-9有熒光響應(yīng)。探針被MMP-2和MMP-9酶響應(yīng)后Cy5.5發(fā)射熒光，隨后通過(guò)Cy5.5和Cy7這2種不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比值可以間接反映酶含量，從而對(duì)MMP-2和MMP-9相關(guān)組織微環(huán)境進(jìn)行半定量分析。更重要的是，DFNP能夠在活體內(nèi)有效聚集到淋巴結(jié)，在小鼠腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中產(chǎn)生可靠的比率信號(hào)，提供淋巴結(jié)中MMP-2和MMP-9的活性信息，并且監(jiān)測(cè)結(jié)果與組織學(xué)分析結(jié)果一致。還可以通過(guò)DFNP淋巴結(jié)成像情況監(jiān)測(cè)癌癥光動(dòng)力治療后的反應(yīng)，具有癌癥治療中診斷和預(yù)后分析潛力。

近年來(lái)，診療一體化響應(yīng)型納米結(jié)構(gòu)熒光探針引起了研究者的廣泛關(guān)注。Ye等[24]報(bào)道了一種靶向MMP-2的激活型納米探針(T-MAN)，具有熒光/磁共振雙模態(tài)成像和光熱治療功能。首先，將Gd摻雜到CuS納米盤中，用聚乙二醇(PEG2000)修飾的兩親性磷脂聚合物(DSPE-PEG2000)包裹形成膠束，然后通過(guò)膠束外層的氨基連接MMP-2響應(yīng)的基團(tuán)((QSY21)GGPLGVRGK(Cy5.5)-SH)和腫瘤靶向配體(cRGD)。其響應(yīng)是通過(guò)特異性識(shí)別肽GGPLGVRGK被MMP-2切割后釋放Cy5.5，實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)。MMP-2響應(yīng)后熒光增強(qiáng)185倍，可實(shí)現(xiàn)小鼠活體胃腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的熒光成像。在808 nm激光下，T-MAN的光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá)到70%，能夠高效殺死腫瘤細(xì)胞。并且，T-MAN能夠在胃腫瘤中優(yōu)先聚集，實(shí)現(xiàn)小鼠術(shù)中原位胃腫瘤的精確檢測(cè)和激光照射引發(fā)的光熱消融。在此工作基礎(chǔ)上，Ye等[25]開發(fā)的全有機(jī)半導(dǎo)體聚合物納米顆粒可以實(shí)現(xiàn)靶向MMP-2的近紅外比率型熒光探針成像，有效提高體內(nèi)熒光成像能力。

2.2 組織蛋白酶

組織蛋白酶是廣泛分布于組織中的溶酶體蛋白酶。已發(fā)現(xiàn)的組織蛋白酶可根據(jù)其活性部位氨基酸分為3類，分別為天冬氨酸(2種)、半胱氨酸(11種)和絲氨酸(2種)蛋白酶。組織蛋白酶在所有哺乳動(dòng)物溶酶體中廣泛表達(dá)，但在多種腫瘤細(xì)胞以及癌前病變組織中過(guò)度表達(dá)和激活，可以調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。

Blau等[27]開發(fā)了組織蛋白酶響應(yīng)的近紅外熒光納米探針，可用于術(shù)中導(dǎo)航，精確檢測(cè)腫瘤邊界。他們?cè)O(shè)計(jì)合成了3種探針，結(jié)構(gòu)如圖3a所示。探針體系1(P-GFLG-Cy5)采用不可降解的N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物和可降解的肽鏈甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GFLG)連接Cy5組成熒光較弱的自淬滅探針，酶響應(yīng)識(shí)別GFLG，切斷肽鏈，Cy5脫離聚合物產(chǎn)生熒光。探針體系2(PC)由可生物降解的聚-L-谷氨酸(PGA)聚合物主鏈組成，該主鏈連接有自淬滅的分子Cy5，形成PGA-Cy5，酶降解PGA后Cy5熒光信號(hào)增強(qiáng)。探針體系3(PCQ)基于FRET原理，Cy5與淬滅劑連接在PGA上，與蛋白酶作用后二者斷開激活熒光。在原位乳腺癌和黑色素瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移到大腦的模型中，腫瘤組織熒光信號(hào)穩(wěn)定，腫瘤與背景的信噪比提高，在手術(shù)過(guò)程中描繪了腫瘤邊界，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的精準(zhǔn)切除。這種“智能”聚合物探針有可能幫助外科醫(yī)生在手術(shù)期間實(shí)時(shí)確定腫瘤邊界，從而改善患者預(yù)后。

圖3 組織蛋白酶響應(yīng)的3種術(shù)中導(dǎo)航熒光探針結(jié)構(gòu)(a)[27]，自組裝雙響應(yīng)診療一體化納米探針(b)[29]Fig.3 Cathepsin responsive three intraoperative navigation fluorescent probe structures (a) [27], self-assembled double response integrated nano probe (b) [29]

Cai等[28]也利用HPMA共聚物，通過(guò)共軛化學(xué)方法制備出連接有標(biāo)記染料Cy5.5的GFLG肽鏈、釓螯合物及化療藥紫杉醇(PTX)的支化聚合物，隨后通過(guò)自組裝形成刺激響應(yīng)聚合物前藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)生物相容性良好、生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性高，但在腫瘤微環(huán)境中會(huì)迅速降解和釋放PTX。實(shí)驗(yàn)表明，該納米復(fù)合探針可以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)溶酶體組織蛋白酶，實(shí)現(xiàn)熒光成像?？鼓[瘤治療方面顯示其對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制能力，并能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的抗腫瘤效果。

Zong等[29]設(shè)計(jì)合成了溶酶體pH和組織蛋白酶雙響應(yīng)納米熒光探針，用于癌細(xì)胞精準(zhǔn)成像和治療。如圖3b所示，探針是通過(guò)組織蛋白酶響應(yīng)肽，將近紅外半菁染料CyNH2與酸響應(yīng)聚合物連接，自組裝形成納米結(jié)構(gòu)。該納米復(fù)合探針在生物體內(nèi)雙重刺激下降解，CyNH2釋放，在激光照射下實(shí)現(xiàn)熒光成像，同時(shí)CyNH2還具有線粒體靶向抑制癌細(xì)胞增殖的效果。實(shí)驗(yàn)表明，這種雙重刺激響應(yīng)納米熒光診療探針，相較于單一響應(yīng)的探針具有更好的選擇性和特異性。

2.3 半胱天冬氨酸蛋白酶

半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的酶家族，參與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。具體而言，凋亡啟動(dòng)子(Caspase-8/9)和執(zhí)行子(Caspase-3/7)在程序性細(xì)胞凋亡中發(fā)揮不同的作用。凋亡功能的紊亂與許多疾病相關(guān)，如癌癥的主要特征是細(xì)胞凋亡減少，而神經(jīng)退行性病變則是細(xì)胞凋亡增加，在凋亡增加或減少過(guò)程中，相應(yīng)的半胱天冬氨酸蛋白酶表達(dá)量將上調(diào)或者下調(diào)[30]。因此，許多用于細(xì)胞凋亡Caspase蛋白酶活性檢測(cè)的成像技術(shù)被開發(fā)用于疾病診斷和評(píng)估抗腫瘤效果[31]。

Wang等[32]展示了一種熒光可激活的金納米星(AuNS)復(fù)合探針，該探針可被Caspase-3激活熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞凋亡成像，并通過(guò)細(xì)胞凋亡程度的成像反應(yīng)出探針抗腫瘤光熱治療效果。如圖4a所示，金納米星作為內(nèi)核和載體，在其表面修飾連接標(biāo)記過(guò)熒光染料Atto 655的Caspase-3響應(yīng)肽(DEVD)，由于FRET效應(yīng)，在連接狀態(tài)下，金納米星吸收染料Atto 655的熒光，探針熒光被淬滅，而該探針對(duì)Caspase-3響應(yīng)后，染料分子和金納米星二者距離變大，不能進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移，染料熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)Caspase-3檢測(cè)成像。此外，該納米復(fù)合探針表面還修飾了葉酸，主動(dòng)靶向高表達(dá)葉酸受體的癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞有效內(nèi)吞并累積更多的熒光診療納米探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在近紅外光照條件下，該探針的光熱效應(yīng)導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，典型的凋亡效應(yīng)蛋白酶Caspase-3被激活，終止探針分子內(nèi)熒光淬滅，出現(xiàn)明顯的熒光恢復(fù)。利用激活的熒光可以精準(zhǔn)評(píng)估Caspase-3表達(dá)和探針實(shí)時(shí)治療效果。這種新型多功能納米復(fù)合材料可以作為腫瘤靶向治療效果監(jiān)測(cè)、評(píng)估一體化診療探針。

圖4 Caspase-3響應(yīng)的金納米星診療探針(a)[32]，Caspase-3/8響應(yīng)的納米纖維探針合成原理示意圖(b)[35]Fig.4 Caspase-3 responsive AuNS@probe structure (a)[32], Schematic of the preparation of Caspase-3/8 responsive nanofiber probe (b)[35]

與前文所述的金納米星在探針中作為淬滅劑不同，Yin等[33]開發(fā)了金納米簇作為熒光信號(hào)分子，金屬有機(jī)骨架NH2-MIL-101(Fe)作為熒光淬滅基團(tuán)和化療藥物喜樹堿的載體。金納米簇通過(guò)Caspase-3響應(yīng)型多肽連接到MOFs表面，同時(shí)表面還修飾了連接葉酸的聚乙二醇。當(dāng)探針被細(xì)胞內(nèi)吞后，化療藥物喜樹堿被釋放產(chǎn)生殺傷作用，凋亡指示蛋白上調(diào)，特異性切割金納米簇與MOFs之間的肽鏈，金納米簇?zé)晒怆S即恢復(fù)，通過(guò)熒光和質(zhì)譜分析量化Caspase-3的表達(dá)量，檢測(cè)限可達(dá)0.12 ng·mL-1。

Li等[34]利用MoS2納米片(NSs)開發(fā)了一種新型的二維納米材料，用于檢測(cè)Caspase-3，在生物熒光成像方面顯示出巨大的潛力。通過(guò)聚多巴胺(PDA)共價(jià)生物修飾MoS2策略，構(gòu)建了一種細(xì)胞內(nèi)熒光成像生物探針MoS2@PDA-PEG肽(MPPP)，用于測(cè)定Caspase-3活性。相比于傳統(tǒng)的配位修飾，共價(jià)修飾可顯著提高生物分子的共軛效率，并且增強(qiáng)納米復(fù)合物在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證明，該二維材料具有可靠的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出對(duì)Caspase-3的高靈敏度和高選擇性檢測(cè)，檢測(cè)限為0.33 ng·mL-1。

Zhang等[35]開發(fā)了一維納米線材料，具有熒光“開啟”特性，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的Caspase-3/8活性。探針設(shè)計(jì)原理示意圖如圖4b所示，合成NAP-GFFPYDEVD-AFC和NAP-GFFPEIETD-AFC這2種單體，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，首先被細(xì)胞膜表面的堿性磷酸酶(ALP)催化，自組裝形成納米纖維廣泛分布在細(xì)胞膜表面上，納米線被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，Caspase-3/8識(shí)別IETD/DEVD序列，切割探針，并釋放7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)熒光基團(tuán)，游離AFC熒光強(qiáng)度與細(xì)胞質(zhì)中相應(yīng)的半胱天冬氨酸蛋白酶的活性成正比，可用于細(xì)胞Caspase-3/8檢測(cè)成像。

預(yù)包裝的現(xiàn)制現(xiàn)售食品，現(xiàn)場(chǎng)分裝或包裝食品應(yīng)張貼標(biāo)簽；標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)至少包括品名、生產(chǎn)日期與保質(zhì)日期、保存條件、大賣場(chǎng)的名稱、地址、聯(lián)系電話；應(yīng)按標(biāo)簽標(biāo)注的儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存和銷售；張貼標(biāo)簽后的產(chǎn)品不得再更改生產(chǎn)日期與保質(zhì)期，也不得以加貼形式覆蓋原來(lái)的生產(chǎn)日期與保質(zhì)期；分裝食品的保質(zhì)期不得長(zhǎng)于原包裝上的保質(zhì)期。

2.4 胰蛋白酶

胰蛋白酶是一類絲氨酸蛋白酶，主要水解含有賴氨酸和精氨酸的肽和酯。它與人類多種病理過(guò)程，如囊性纖維化、胰腺癌、胰腺炎、組織壞死、細(xì)胞凋亡等相關(guān)。因此，檢測(cè)胰蛋白酶的異常在相關(guān)疾病的研究中非常重要[36]。

Hu等[37]利用D-青霉胺作為穩(wěn)定劑和還原劑，制備了銅納米簇(CuNCs)，CuNCs的熒光激發(fā)/發(fā)射(390 nm/645 nm)在很大程度上是通過(guò)涂覆聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)來(lái)穩(wěn)定的。設(shè)計(jì)原理如圖5a，細(xì)胞色素c(Cyt c)可淬滅PSS覆蓋的CuNCs熒光，在負(fù)載Cyt c的CuNCs中加入胰蛋白酶，Cyt c被水解成肽片段，CuNCs的熒光逐漸恢復(fù)。Hu等據(jù)此建立了一種高靈敏度的熒光檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)血清中的胰蛋白酶。結(jié)果顯示，胰蛋白酶的線性檢測(cè)范圍為0.1～6.0 μg·mL-1，檢測(cè)限為20 ng·mL-1。

Xue等[38]開發(fā)了硅納米粒子(SiNPs)引發(fā)的金納米簇聚集誘導(dǎo)發(fā)射增強(qiáng)，用于魚精蛋白和胰蛋白酶的比率檢測(cè)探針。在這項(xiàng)工作中，由于靜電相互作用，氨基修飾的硅納米粒子和谷胱甘肽封端的金納米簇(GSH-AuNCs)自組裝成球形粒子SiNPs@GSH-AuNCs。SiNPs@GSH-AuNCs具有獨(dú)特的570 nm處聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)射增強(qiáng)(aggregation-induced emission enhancement, AIEE)現(xiàn)象。將魚精蛋白加入到SiNPs@GSH-AuNCs體系，陽(yáng)離子魚精蛋白與SiNPs競(jìng)爭(zhēng)，吸附到GSH-AuNCs表面，抑制自組裝，終止AIEE現(xiàn)象，570 nm處熒光減弱淬滅，但胰蛋白酶可以催化魚精蛋白水解，自組裝抑制元素消失，AIEE恢復(fù)。在整個(gè)過(guò)程中，SiNPs充當(dāng)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，其450 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度保持不變，檢測(cè)中通過(guò)I570/I450熒光強(qiáng)度比獲得魚精蛋白和胰蛋白酶濃度。該探針應(yīng)用于血清樣品中魚精蛋白和胰蛋白酶的測(cè)定，顯示出良好的靈敏度和選擇性。

除了金屬納米團(tuán)簇具有熒光發(fā)射性能以外，聚多巴胺納米粒子(PDNPs)也具有熒光性能。Li等[39]通過(guò)羥基自由基誘導(dǎo)納米顆粒降解的方法獲得直徑4.8 nm帶負(fù)電荷的熒光PDNPs，并將其開發(fā)為胰蛋白酶檢測(cè)探針。帶負(fù)電的PDNPs具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度，但與帶正電的魚精蛋白(protamine, Pro)結(jié)合后，形成PDNPs-Pro聚集納米粒子熒光發(fā)射受到限制。PDNPs-Pro聚集納米粒子用于檢測(cè)胰蛋白酶時(shí)，胰蛋白酶水解魚精蛋白，使PDNPs-Pro變回PDNPs恢復(fù)熒光。熒光對(duì)胰蛋白酶濃度的線性檢測(cè)范圍為0.01～0.1 mg·mL-1，最低檢測(cè)限為6.7 ng·mL-1。

Hu等[40]提出了基于黑磷納米片(BPs)的蛋白酶檢測(cè)和抑制劑篩選系統(tǒng)，圖5b顯示了其工作原理。苝探針(Probe 1)的水溶液顯示強(qiáng)熒光，二維材料BPs可以通過(guò)靜電相互作用吸附苝探針并淬滅探針熒光，組蛋白(Histone)可以控制苝探針和BPs之間的相互作用，通過(guò)蛋白酶的引入調(diào)節(jié)熒光實(shí)現(xiàn)酶活性檢測(cè)。該探針無(wú)需標(biāo)記、靈敏度高、選擇性好，胰蛋白酶檢測(cè)限低至1 ng·mL-1。

圖5 銅納米簇檢測(cè)胰蛋白酶示意圖(a)[37]；基于黑磷納米片的蛋白酶檢測(cè)系統(tǒng)(b)[40]Fig.5 Schematic of trypsin detection by copper nanoclusters (a) [37]; protease detection system based on black phosphorus (b) [40]

2.5 其他蛋白酶

人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)是一種典型的蛋白酶，其表達(dá)情況與肺部炎癥疾病和肺癌密切相關(guān)，具有成為這類疾病預(yù)測(cè)因子的潛力。Liu等[41]將HNE特異性肽底物、量子點(diǎn)(QD)和有機(jī)染料結(jié)合在一起，基于FRET原理，制備了納米探針QDP，實(shí)現(xiàn)HNE的體外檢測(cè)和體內(nèi)成像。QDP能夠在水溶液中特異性地測(cè)量HNE，靈敏度高達(dá)7.15 pmol·L-1，并成功地在活細(xì)胞中進(jìn)行了內(nèi)源性和外源性HNE靶向成像。此外，這種納米探針能夠在肺癌和急性肺損傷的小鼠模型中進(jìn)行HNE成像，并持續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間和空間分辨率下的HNE活性。最重要的是，QDP對(duì)HNE活性的測(cè)定可以成功地將肺部疾病患者的血清與健康對(duì)照組的血清區(qū)分開來(lái)，證明QDP在成像性能方面的優(yōu)勢(shì)，為活體HNE檢測(cè)和肺部疾病診斷提供了一種適用的工具(圖6a)。

成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)在許多癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，其具有二肽基肽酶活性和明膠酶活性，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮巨大作用[42]。Han等[43]基于聚多巴胺涂層包覆金納米星(GNS@PDA)這一納米體系，在其表面偶聯(lián)Cy7標(biāo)記的FAP識(shí)別肽，實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)斷層成像/光聲/雙光子發(fā)光/紅外熱成像及治療一體化的多模態(tài)熒光納米診療探針(圖6b)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GNS@PDA表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱性能和高效的腫瘤累積。FAP響應(yīng)近紅外熒光活體成像揭示了關(guān)于腫瘤的病理信息，在多模態(tài)成像的精確指導(dǎo)下，Han等利用GNS@PDA在小鼠模型中進(jìn)行了大體積實(shí)體瘤(200 mm3)的均勻光熱消融，表明這種納米探針在癌癥治療中有巨大的轉(zhuǎn)化前景。

圖6 量子點(diǎn)探針靶向HNE成像原理及應(yīng)用(a)[41]，F(xiàn)AP響應(yīng)熒光成像的多功能金納米星探針GNS@PDA(b)[43]Fig.6 Mechanism and application of quantum dot probe targeted HNE (a)[41], multifunctional GNS@PDA probe for FAP response fluorescence imaging(b)[43]

弗林蛋白酶(furin)是一種前體蛋白轉(zhuǎn)化酶，在許多疾病中起重要作用。據(jù)報(bào)道，弗林蛋白酶與多種癌癥高度相關(guān)，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌[44]。Hai等[45]開發(fā)了細(xì)胞內(nèi)弗林蛋白酶檢測(cè)的熒光探針Cys(StBu)-Lys(Gly-Lys(DABCYL)Gly-Gly-Arg-Arg-Val-Arg-Gly-FITC)-CBT，在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽響應(yīng)后，點(diǎn)擊縮合反應(yīng)自組裝成納米粒子，再被弗林蛋白酶剪切釋放探針上的染料(FITC)以實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)，完成靈敏的酶活性熒光成像。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文總結(jié)了近5年內(nèi)開發(fā)的蛋白酶靶向熒光納米診療探針，依照蛋白酶所屬家族將其分為5大類，并對(duì)其中數(shù)十種蛋白酶靶向熒光納米探針進(jìn)行了詳細(xì)的描述，主要包括探針設(shè)計(jì)原理、探針結(jié)構(gòu)及其在生物醫(yī)學(xué)方面的熒光診療特性等。總體而言，蛋白酶靶向熒光納米探針的設(shè)計(jì)主要是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，利用蛋白酶水解功能釋放熒光信號(hào)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)熒光響應(yīng)。納米探針材料的主要構(gòu)成部分涵蓋了貴金屬納米簇、熒光納米上轉(zhuǎn)換顆粒、量子點(diǎn)、有機(jī)納米聚合顆粒、納米纖維、自組裝納米膠束以及金屬有機(jī)骨架結(jié)構(gòu)等。相較于小分子熒光探針，熒光納米探針的合成和設(shè)計(jì)更為復(fù)雜，可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)融合在統(tǒng)一平臺(tái)體系，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。

盡管目前已經(jīng)開發(fā)了許多蛋白酶靶向熒光納米診療探針，但依然存在一些問題限制其進(jìn)一步的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)化。首先，熒光納米探針的穩(wěn)定性和靈敏性有待進(jìn)一步提高。探針溶液穩(wěn)定性可通過(guò)對(duì)納米系統(tǒng)進(jìn)行水溶性修飾來(lái)改善，探針熒光穩(wěn)定性可選擇搭載光學(xué)性能好的新一代熒光染料；探針靈敏性則需要尋找更加有效的靶向識(shí)別基團(tuán)或者采用更加先進(jìn)的設(shè)計(jì)原理，提升探針的靈敏性和抗干擾性能。其次，蛋白酶靶向的熒光納米診療探針的應(yīng)用主要停留在細(xì)胞或動(dòng)物腫瘤模型層面，熒光納米探針在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等相關(guān)研究還相對(duì)較少，需要材料學(xué)和臨床病理學(xué)等學(xué)科交叉的研究者合作，推進(jìn)熒光納米探針的進(jìn)一步應(yīng)用。這也是目前所有納米藥物研發(fā)面臨的問題。綜上，在未來(lái)的蛋白酶靶向熒光納米探針的設(shè)計(jì)開發(fā)研究中，應(yīng)在滿足成像和治療功能的同時(shí)，考慮探針的體內(nèi)毒性，對(duì)其安全性進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，這是熒光納米探針能否實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。