lncRNA FOXD2-AS1對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究

林素仙，王牡丹，王勝男，楊美綠，張智勇，盧陽

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的病理特征之一是關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞“腫瘤樣”增生；此外，炎性細(xì)胞浸潤及軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞也與其密切相關(guān)[1-2]。RA滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）在RA滑膜增生、關(guān)節(jié)炎癥、軟骨關(guān)鍵破壞等方面起著關(guān)鍵作用[3-5]。lncRNA參與炎癥、細(xì)胞異常增殖和凋亡等病理過程，在RA的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[6]。骨關(guān)節(jié)炎與RA都是常見的風(fēng)濕性疾病，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)上調(diào)與骨關(guān)節(jié)炎患者的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其可通過海綿化miR-27a-3p在骨關(guān)節(jié)炎中誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖[7]。抑制FOXD2-AS1可通過靶向miR-206/CCND1軸抑制軟骨細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。然而lncRNA FOXD2-AS1對RASFs增殖和凋亡影響及機(jī)制尚未清楚。miR-331-3p具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[9]；但miR-331-3p對RASFs增殖、凋亡影響也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA FOXD2-AS1對RASFs增殖和凋亡的 影響，及其機(jī)制是否與miR-331-3p有關(guān)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常滑膜成纖維細(xì)胞（FLSs）和人類RASFs（RASFs）購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司[C0495、GDC（044349673）]；Trizol試劑購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上海易匯生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海北諾生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）和凋亡檢測試劑盒購自北京利維平生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)FLSs和RASFs，將lncRNA FOXD2-AS1陰性對照（si-NC）、lncRNA FOXD2-AS1小分子干擾RNA（silncRNA FOXD2-AS1）、miR-331-3p寡核苷酸模擬物（miR-331-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）（廣州銳博生物）分別轉(zhuǎn)染至RASFs中，記為si-NC組、si-lncRNA FOXD2-AS1組、miR-331-3p組、miR-NC組，正常培養(yǎng)細(xì)胞作為NC組；將si-lncRNA FOXD2-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-331-3p轉(zhuǎn)染至RASFs中，記為anti-miR-NC+silncRNA FOXD2-AS1 組、antimiR-331-3p+si-lncRNA FOXD2-AS1組。

1.3 RT-qPCR檢測lncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p表達(dá) 提取FLSs及各組RASFs中總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（42℃反應(yīng)1 h，95℃5 min），按照試劑盒說明進(jìn)行PCR，擴(kuò)增的條件：94℃2 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；72℃延伸5 min；然后進(jìn)行融解曲線；用2－△△Ct法計(jì)算lncRNA FOXD2-AS1相對GAPDH、miR-331-3p相對U6表達(dá)量。lncRNA FOXD2-AS1正向引物5’-ACCCA-GGAAATTCCAATTCC-3’，反 向 引 物5’-AAGGGGATCCATTTAATGTGC-3’；miR-331-3p正向引物5’-GGAGAGAAAGGCAGTTCCTG-3’，反 向 引 物5’-GGACCAGAGGAAAGC-CAG-3’；U6正向引物5’-ATTGG -AACGATACAGAGAAGATT-3’，反 向 引 物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向 引 物 5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別孵育CyclinD1（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶800）、-actin（1∶1 000）一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），反應(yīng)條件分別為加入一抗稀釋液后進(jìn)行4℃孵育（24 h），加入二抗稀釋液后室溫孵育1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞活性 各組細(xì)胞（1×106個/ml）接種于96孔板（100 l/孔），將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)向每孔中加入CCK-8溶液10 l，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（A）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，將500 l Binding Buffer加入細(xì)胞沉淀中重懸細(xì)胞，分別將Annexin V-FITC（5 l）與PI（5 l）加入懸浮細(xì)胞中，充分混勻后室溫避光孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)載入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-lncRNA FOXD2-AS1、突變型載體MUT-lncRNA FOXD2-AS1，WT-lncRNA FOXD2-AS1、MUT-lncRNA FOXD2-AS1分別與miR-331-3p mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染至RASFs中，將轉(zhuǎn)染后的RASFs置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間各檢測指標(biāo)比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)；兩組比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLSs和RASFs中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p表達(dá)RASFs中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)較FLSs高（1.73±0.12 vs 1.00±0.09，t=14.600，P＜0.05），miR-331-3p表達(dá)低（0.47±0.03 vs 1.00±0.10，t=15.229，P＜0.05）。

2.2 lncRNA FOXD2-AS1對RASFs增殖和凋亡的影響si-lncRNA FOXD2-AS1組lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)量、CyclinD1表達(dá)水平、A值較NC組和si-NC組低，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3較NC組和si-NC組高（均P＜0.05），見表1。

表1 lncRNA FOXD2-AS1對RASFs增殖和凋亡的影響（=9）

2.3 miR-331-3p對RASFs增殖和凋亡的影響miR-331-3p組miR-331-3p表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3水平較NC組和miR-NC組高（P＜0.05），CyclinD1表達(dá)水平、A值較NC組和miR-NC組低（均P＜0.05），見表2。

表2 miR-331-3p對RASFs增殖和凋亡的影響（=9）

2.4 lncRNAFOXD2-AS1與miR-331-3p靶向關(guān)系lncRNA FOXD2-AS1與miR-331-3p有結(jié)合位點(diǎn)（表3）。共轉(zhuǎn)染 WT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的細(xì)胞熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的 細(xì) 胞 低（0.46±0.03 vs 1.00±0.08，t=18.961，P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染 MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.05±0.09 vs 1.00±0.06，t=1.387，P=0.185）。miR-331-3p在si-lncRNA FOXD2-AS1組細(xì)胞中表達(dá)水平較si-NC組 高（2.04±0.14 1.00±0.02，=22.062，P＜0.05）。

表3 lncRNA FOXD2-AS1和miR-331-3p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

2.5 anti-miR-331-3p與si-lncRNA FOXD2-AS1共轉(zhuǎn)染對RASFs增殖和凋亡的影響anti-miR-331-3p+si-lncRNA FOXD2-AS1組細(xì)胞中的miR-331-3p表達(dá)量、Cleaved-caspase-3水平、細(xì)胞凋亡率較anti-miR-NC+si-lncRNA FOXD2-AS1組低，CyclinD1表達(dá)水平、A值較anti-miR-NC+si-lncRNA FOXD2-AS1組高（均P＜0.05），見表4。

表4 anti-miR-331-3p與si-lncRNA FOXD2-AS1共轉(zhuǎn)染對RASFs增殖、凋亡的影響（=9）

3 討論

RA特征之一就是滑膜成纖維細(xì)胞的大量增生，滑膜成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有相似的增生特征，其異常增殖可侵蝕軟骨，最終破壞骨關(guān)節(jié)[10-11]。因此，抑制RASFs異常激活是有效防治RA的重要途徑和方法。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與調(diào)控RASFs的增殖和凋亡；如lncRNA PVT1可以通過靶向miR-145-5p調(diào)節(jié)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)[12]。NEAT1的上調(diào)促進(jìn)了RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，并抑制了細(xì)胞凋亡[13]。沉默HOTTIP抑制RASFs增殖，侵襲和遷移，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[14]。以上研究表明多種lncRNA均參與調(diào)控RASFs的增殖和凋亡。為研究lncRNA FOXD2-AS1在RASFs中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先檢測了FLSs和RASFs中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，RASFs中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平高于FLSs。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)可降低細(xì)胞活性，提高細(xì)胞凋亡率升高。這表明抑制lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)可抑制RASFs增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA與RASFs的異常增殖相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1可靶向miR-331-3p；低表達(dá)lncRNA FOXD2-AS1后，miR-331-3p表達(dá)水平升高，這說明lncRNA FOXD2-AS1可負(fù)調(diào)控miR-331-3p表達(dá)。Zhang等[16]研究顯示，miR-331-3p是脊髓損傷大鼠脊髓中表達(dá)下調(diào)的miRNA，過表達(dá)miR-331-3p可通過靶向抑制靶基因RAP1A的表達(dá)減輕脊髓損傷大鼠脊髓組織損傷、神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)，miR-331-3p是脊髓損傷治療的分子靶點(diǎn)。Ding等[17]研究顯示，miR-331-3p在骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織、IL-1介導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-331-3p減輕L-1介導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)RASFs中miR-331-3p表達(dá)水平降低；過表達(dá)miR-331-3p可降低RASFs細(xì)胞活性，提供細(xì)胞凋亡率。且抑制miR-331-3p表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)對RASFs增殖和凋亡的影響。