母鼠子癇前期炎癥刺激致子鼠腎臟發(fā)育不良的作用機(jī)制研究

白 瑩，孫靜莉

子癇前期在全球范圍內(nèi)發(fā)病率為3%～5%，嚴(yán)重威脅母嬰健康[1-3]。該病主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓伴蛋白尿，合并多器官損傷[4-6]。母體妊娠期間的炎癥免疫反應(yīng)是導(dǎo)致胎兒腎臟疾病的重要原因之一[7-8]。孕鼠子癇前期細(xì)胞因子釋放增加，影響胎鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致子代大鼠腎臟疾病，分析二者之間的關(guān)系，可能為預(yù)防胎鼠腎臟病變提供參考[9-10]。母鼠子癇前期炎癥免疫通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)影響胎鼠，導(dǎo)致胎鼠發(fā)育不良，尤其對胎鼠腎臟的發(fā)育影響最為關(guān)鍵[11]。但是目前已有的研究尚不完善，因此我們通過觀察母鼠子癇前期炎癥刺激狀態(tài)，探究其對子代腎臟發(fā)育不良的影響。

1 資料與方法

1.1孕鼠模型的建立 健康成年SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g。飼養(yǎng)屏障環(huán)境設(shè)施中，飼養(yǎng)管理人員是受過訓(xùn)練的專業(yè)人員。成年雄性和雌性大鼠交配每籠1∶4，室溫(24±1)℃，用于孕鼠模型建立。第2天7:00和19:00，對雌性大鼠進(jìn)行檢查，以確定模型是否制備成功。陰道或陰道涂片陽性為孕0 d。將未孕雌性大鼠作為空白組(n=12)。本研究通過我院實(shí)驗(yàn)動物管理和使用批準(zhǔn)。

1.2分組及處理 將24只孕鼠隨機(jī)均分為模型組和對照組，妊娠第10天，模型組給予左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，美國sigma公司)125 mg/(kg·d)皮下注射至妊娠第19天。對照組等時(shí)等量皮下注射生理鹽水?？瞻捉M不做處理。妊娠第20天檢測大鼠尾動脈血壓及24 h尿蛋白，子癇早期模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為血壓升高>30 mmHg[12]。子鼠出生后由母鼠喂養(yǎng)30 d，每組隨機(jī)挑選2只子鼠(一雌一雄)，雌雄分籠飼養(yǎng)，定期喂養(yǎng)，自由飲水?；\內(nèi)環(huán)境和飼養(yǎng)條件相同。處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠和子鼠，收集組織樣本。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.124 h尿蛋白檢測[13]：清晨8：00，將1月齡子鼠放入代謝籠中，可自由活動、飲食，次日清晨收集尿液，采用全自動生化儀測定尿蛋白濃度。

1.3.2腎功能和炎性因子測定：母鼠及子鼠均采用尾尖采血。將大鼠固定好，鼠尾置于45～50 ℃熱水中浸泡數(shù)分鐘或用乙醇反復(fù)擦拭消毒、擴(kuò)張尾靜脈血管，擦干鼠尾備好取血位置。在大鼠尾尖5～10 mm處用剪刀剪下，按摩尾根至尾尖，將大鼠血液置于枸櫞酸鈉抗凝試管中，取血1～3 ml。取血后注意保護(hù)傷口。血樣離心分離上清，-80 ℃保存待檢。采用CX-7全自動生化分析儀(美國貝克曼)，測定血清肌酐(Scr)和尿素(BUN)水平。ELISA檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.4腎臟組織獲取及HE染色 子鼠喂養(yǎng)30 d后處死。處理方法：乙醚麻醉后用力抓大鼠背部牽拉，按住大鼠頭部，脊髓和大腦斷裂死亡，立即稱重。暴露腹部，小心分離子鼠腎臟。將取出的組織蒸餾水沖洗后固定，石蠟包埋切片，厚度5 μm，置于載玻片，并標(biāo)記，烘烤干燥。采用HE染色方法，染色步驟同HOCHSTIM等[14]研究中提及的方法，于光鏡下觀察腎臟形態(tài)并采集典型病變圖像。

1.5qRT-PCR檢測腎素(Renin)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素(Ang)mRNA表達(dá)情況 取子鼠腎臟組織搗碎，依次加入1 ml TRIzol裂解液(劇烈振蕩)，加入0.2 ml氯仿(離心取上清)，加入70%乙醇(振蕩混勻)，提取純化組織RNA，將濃度和純度合格的RNA保存于-80 ℃?zhèn)溆?，防止降解。參照qRT-PCR試劑盒(Invitrogen貨號：11752-050)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物(北京擎科生物)設(shè)計(jì)序列(5 '-3 ')：Renin Sense：GGGTGCTAAAGGAGGAAGTGTT，Antisense：AGTGAAAGTTGCCCTGGTAATG；ACE Sense：TCCACCGTTACCAGACAACTATCC，Antisense：CTGCGTATTCGTTCCACAACACCT；Ang Sense：CTGGAGCTAAAGGACACACAGA，Antisense：CAGGGTCTTCTCATCCACGG；β-actin Sense：CTTCCTTCCTGGGTATGGAATC，Antisense：CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT。qRT-PCR儀(美國life technologies公司),95 ℃預(yù)變性2 min；40個循環(huán)：95 ℃變性，60 ℃退火，72 ℃延伸。擴(kuò)增結(jié)束計(jì)算待測目的基因Ct值，重復(fù)3次。

1.6Western Blotting檢測Renin、ACE和Ang蛋白表達(dá)情況 采用T-PER(Thermo Pierce公司)提取試劑盒進(jìn)行總蛋白的提取。在8%～12%分離膠中以80 V電泳2 h，在5%濃縮膠中以60 V電泳2 h。甲醇浸泡適宜大小的PVDF膜10 min后，100 V恒壓全濕轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h。一抗稀釋后在4 ℃冰箱孵育過夜，常溫孵育二抗2 h；曝光后分析蛋白條帶光密度值，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.13組大鼠炎性因子水平比較 3組大鼠精神狀態(tài)、活動度、食欲及生存情況良好。與對照組和空白組比較，模型組TNF-α、IL-6和CRP水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠炎性因子水平比較

2.2子鼠腎功能指標(biāo)比較 與對照組比較，模型組子鼠血清BUN、Scr和尿蛋白水平均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 2組子鼠腎功能指標(biāo)比較

2.3子鼠腎臟形態(tài) 對照組子鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球正常，無炎性細(xì)胞浸潤，無明顯病變；模型組子鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹，變性壞死，腎小球毛細(xì)血管充血，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，腎小管管腔變窄，有炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 2組子鼠腎臟病理形態(tài)HE染色結(jié)果

2.4子鼠腎臟組織中Renin、ACE、Ang mRNA表達(dá)情況 與對照組比較，模型組Renin、ACE和Ang mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖2 2組子鼠腎臟RAS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)水平

2.5子鼠腎臟組織Renin、ACE、Ang蛋白表達(dá)情況 與對照組比較，模型組Renin、ACE和Ang蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖3 2組子鼠腎臟RAS系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

子癇前期即是糖、脂代謝和血管功能的應(yīng)激反應(yīng)失敗，與子代多種器官疾病發(fā)生有關(guān)[15-18]。最近研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞可以誘導(dǎo)腎臟的炎癥反應(yīng)[19-21]。母體炎癥水平的異常改變，會對胎兒的腎臟發(fā)育產(chǎn)生一定不良影響[22]。RAS能調(diào)節(jié)腎功能，維持水鹽代謝平衡，同時(shí)調(diào)節(jié)組織生長和發(fā)育[23]。目前，晚期慢性腎臟病除了透析治療外，缺乏其他有效的治療方法[24]。所以我們應(yīng)該尋求腎臟疾病早期防治的方法，關(guān)注母體疾病所致子代腎臟疾病的研究。

本研究采用SD成年健康雌性大鼠建立子癇前期孕鼠模型。建模大鼠精神狀態(tài)、活動度、食欲及生存情況良好。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠炎性因子水平較對照組和空白組升高，而其子鼠血清BUN、Scr和尿蛋白水平較對照組顯著升高。提示生理鹽水處理對孕鼠炎癥水平無顯著影響，而子癇前期孕鼠的子代伴有明顯的腎臟損傷，說明子癇前期孕鼠的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，對子鼠腎臟有明顯損傷作用。國外研究表明，孕婦血清炎性因子與腎臟功能和子宮內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)，提示孕期炎癥是母體腎病及子代腎功能發(fā)育不全的危險(xiǎn)因素[25]。研究表明，子代大鼠RAS系統(tǒng)激活，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率和肌酐清除率降低[26]。進(jìn)一步研究表明，母體孕期炎癥途徑激活后，會引起子代腎臟發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能變化[27]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究結(jié)果顯示，模型組子鼠腎小管上皮細(xì)胞壞死，毛細(xì)血管充血，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，腎小管管腔變窄，有炎性細(xì)胞浸潤，可能與母體炎癥刺激，導(dǎo)致胚胎發(fā)育環(huán)境改變，胎鼠腎臟發(fā)育時(shí)受到低炎癥刺激，影響腎臟的發(fā)育。

RAS系統(tǒng)在腎臟發(fā)育中有至關(guān)重要的作用。研究表明，任何原因，包括使用藥物或基因敲除技術(shù)均能影響腎臟RAS系統(tǒng)及腎臟形態(tài)和功能[28]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致。國內(nèi)外其他研究也表明，RAS系統(tǒng)的所有成分均在腎臟組織中表達(dá)[29]。腎臟RAS系統(tǒng)活性最高[30]。本研究結(jié)果顯示，子代大鼠1月齡時(shí)，模型組RAS系統(tǒng)Renin、ACE和Ang mRNA及蛋白水平高于對照組。與楊曉靜[31]和陶荷花等[32]研究結(jié)果一致?？紤]由于孕鼠子癇前期的炎癥水平增高，抑制了胎鼠RAS活性，從而導(dǎo)致孕期腎臟發(fā)育異常，子鼠娩出后，腎功能受損。

綜上所述，子癇前期孕鼠體內(nèi)高炎癥水平可以激活胎鼠RAS系統(tǒng)影響腎臟功能。本研究樣本量較小，存在統(tǒng)計(jì)誤差，有待進(jìn)一步研究。