微生物發(fā)酵對(duì)口含煙煙葉煙堿與特有亞硝胺含量的影響

楊 靜， 李書貴， 楊 顏， 潘和平

(1.黔東南州煙草公司， 貴州 凱里 556000； 2.施秉縣煙草公司， 貴州 施秉 556200)

0 引言

【研究意義】煙堿(Nicotine)是影響煙葉品質(zhì)的特征性指標(biāo)之一[1]，煙堿的含量與煙民的健康密切相關(guān)，含量過高可能會(huì)對(duì)身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[2]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外控?zé)熜蝿?shì)的日趨嚴(yán)峻，口含煙成為煙草工業(yè)企業(yè)的重要研究方向之一?？诤瑹煯a(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的重要指標(biāo)之一就是煙堿的釋放量[3]，同時(shí)煙堿對(duì)味覺具有很重要的影響，尤其在口含煙中，游離煙堿直接透過口腔黏膜被人體吸收刺激人腦多巴胺的產(chǎn)生從而增加人的滿足感[4]。煙葉煙堿含量偏高，導(dǎo)致入口使用時(shí)刺激性、辛辣味較重。降低煙堿含量有利于降低煙草原料的辛辣感，從而改善口含煙的刺激感。煙草中特有亞硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，簡(jiǎn)稱TSNA)是煙草特有的N-亞硝基類化合物，主要包含N-亞硝基去甲煙堿(NNN)和4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)等，是一組主要的致腫瘤物質(zhì)[5]，是煙葉中重要的有害成分。因此，開展煙葉降害研究對(duì)提高煙草原料品質(zhì)，促進(jìn)煙草企業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】龍章德等[6]從植煙土壤中篩選到一株有效降解煙堿的微生物，并確定其最佳生長(zhǎng)條件及其降解煙堿最大的發(fā)酵條件，在此條件下其降解率達(dá)82%。胡希[7]研究發(fā)現(xiàn)，微生物能夠降低雪茄煙總植物堿的含量。CHOPYK等[4,8-9]研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵對(duì)煙葉化學(xué)成分和評(píng)吸品質(zhì)有一定的影響，能夠很好地降低煙葉煙堿含量，對(duì)提高香氣量改善香氣質(zhì)有很好的作用。普遍認(rèn)為煙草中TSNA是由煙草中的生物堿和亞硝鹽反應(yīng)形成，因此亞硝酸鹽是生成亞硝胺的前提物之一，所以，降低煙葉中亞硝酸鹽含量有助于降低亞硝胺含量，提高口含煙的食用安全性。圍繞微生物對(duì)煙葉發(fā)酵降害作用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量有益的探索，并取得了一定進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物的存在對(duì)亞硝酸鹽含量產(chǎn)生顯著影響[10-11]，通過篩選降硝酸鹽微生物然后接種到煙葉進(jìn)行發(fā)酵可降低煙葉中亞硝胺含量[12-21]。單宏英等[17]研究發(fā)現(xiàn)，醇化煙葉表面的熒光假單胞菌AS97能夠顯著降低煙草特有亞硝胺(TSNA)的含量。李雪梅等[18]從大量煙草內(nèi)生細(xì)菌中篩選出一株能夠顯著降低煙草特有亞硝胺含量的菌株——銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginoseKenLXP30)，通過液體發(fā)酵制備成煙草降害生物制劑，可顯著降低白肋煙煙葉中的TSNA。雷麗萍等[19]篩選出短小芽孢桿菌，其對(duì)晾制煙葉發(fā)酵處理后TSNAs降低17.3%。趙麗萍等[20]從62個(gè)煙葉樣品中分離篩選出1株能以煙堿作為碳氮源和能源的11L140巴氏微桿菌，其具有明顯的降堿功能。張春花等[21]研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物發(fā)酵能夠降低煙葉中農(nóng)藥殘留?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】從目前的應(yīng)用情況看，大多數(shù)微生物煙葉發(fā)酵技術(shù)還處于摸索階段，尚未形成行之有效的適用工業(yè)化生產(chǎn)的煙葉發(fā)酵技術(shù)，且鮮見解淀粉芽孢桿菌(GUHP86)和枯草芽孢桿菌(B01)對(duì)煙草不同等級(jí)煙葉降害研究的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用連續(xù)流動(dòng)分析儀和液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS-MS)測(cè)定解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01發(fā)酵云煙87不同等級(jí)部位煙草原料的煙堿和特有亞硝胺NNN、NNK含量的變化，以期為其在口含煙煙葉提質(zhì)降害上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口含煙原料煙葉 選取貴州省黔東南州煙區(qū)生產(chǎn)的云煙87的下橘二(X2F)、中橘三(C3F)和上橘二(B2F)3個(gè)部位的煙葉，用清水洗凈后分別放入40℃以下烘箱中低溫烘干，粉碎密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 微生物 解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01，由貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 自制。含胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g及葡萄糖1 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。

1.1.4 有糖鹽溶液 自制。MgCl20.5 g、KCl 0.5 g、CaCl220.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，溶解滅菌后備用。

1.1.5 儀器與設(shè)備 多通道連續(xù)流動(dòng)分析儀、三維隨機(jī)自動(dòng)取樣器、高精度蠕動(dòng)、泵雙光束比色計(jì)，AA3德國(guó)SEAL公司；液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)，美國(guó)Thermofisher公司；Waters Xterra C8s色譜柱50 mm×2.1 mm，粒徑3.5 μm，Waters公司；DQ8純水、超純水一體系統(tǒng)，法國(guó)默克公司。

1.2 方法

1.2.1 制備種子液 準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后接入菌種，180 r/min、37℃培養(yǎng)18 h。解淀粉芽孢桿菌GUHP86種子液活菌濃度為9.58 CFU/mL、枯草芽孢桿菌B01種子液活菌濃度為9.56 CFU/mL。在無菌操作臺(tái)中將培養(yǎng)好的菌株分別放入均等的大離心管中，于1 350 r/min離心10 min。離心以后，倒出上清液，保留菌體，然后加入20 mL滅菌生理鹽水，搖勻備用。

1.2.2 煙草原料發(fā)酵 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：T1，煙葉分別加入20% GUHP86+20%有糖鹽溶液，37℃發(fā)酵20 d；T2，加入30% B01+25%有糖鹽溶液，37℃發(fā)酵20 d；空白對(duì)照(CK)，不添加微生物進(jìn)行發(fā)酵。分別稱取3個(gè)部位(X2F、C3F和B2F)的煙葉粉末各20 g分別裝入14 cm×10 cm的無菌密封袋，滅菌。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)吸取適量離心管內(nèi)菌液于煙粉塑封袋內(nèi)，適量加入鹽溶液，充分混勻，貼上標(biāo)簽放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，每天需進(jìn)行換氣，分別取0 d、5 d、10 d、15 d和20 d的發(fā)酵煙草原料，將煙粉在115℃下滅菌20 min后[22-23]，測(cè)定煙堿及特有亞硝酸鹽含量。

1.2.3 樣品檢測(cè) 煙堿參照《煙草及煙草制品總植物堿的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》(YC/T 468—2013)[23]進(jìn)行測(cè)定。特有亞硝胺參照文獻(xiàn)[24-26]的方法采用液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀定量分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物發(fā)酵各部位煙葉的煙堿含量

從圖1看出，3個(gè)部位煙葉的煙堿含量隨各微生物發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈慢快慢下降趨勢(shì)。

2.1.1 X2F 發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T1下降最多，降解率為5.95%；T2其次，降解率為5.00%；CK最少，降解率為2.73%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降17.30%和11.11%，均較CK(6.01%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，煙堿含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降19.46%、15.00%和7.65%，T1下降最多，T2次之。

2.1.2 C3F 發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為9.25%；T1其次，降解率為5.50%；CK最少，降解率為3.05%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降38.14%和33.81%，T1的降速大于T2，二者均較CK(5.61%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，煙堿含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降40.89%、38.43%和8.77%，T1下降最多，T2次之。

2.1.3 B2F 發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T1下降最多，降解率為9.33%；T2其次，降解率為6.92%；CK最少，降解率為5.09%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降44.04%和40.00%，均較CK(6.97%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，煙堿含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降50.78%、44.36%和8.58%，T1下降最多，T2次之。

總體看，T1對(duì)煙堿的降解效果最好，T2次之，2種微生物的降解效果集中在發(fā)酵后10～15 d，最佳發(fā)酵時(shí)間為15 d。

2.2 不同微生物發(fā)酵各部位煙葉的特有亞硝酸鹽含量

2.2.1 N-亞硝基去甲煙堿(NNN) 從圖2看出，3個(gè)部位煙葉的NNN含量隨不同微生物發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈慢快慢降低趨勢(shì)。

1) B2F。發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為19.96%；T1其次，降解率為17.42%；CK最少，降解率為5.27%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降51.49%和42.98%，T1的降速超過T2，二者均均較CK(5.82%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，NNN含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降64.39%、55.59%和7.58%，T1下降最多，T2次之。

2) C3F。發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為19.44%；T1其次，降解率為14.33%；CK最少，降解率為3.94%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降54.27%和44.31%，T1的降速超過T2，二者的降速均超過CK(6.19%)。發(fā)酵15～20 d時(shí)，NNN含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降59.62%、54.86%和7.45%，T1下降最多，T2次之。

3) X2F。發(fā)酵0～10 d時(shí)各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為8.54%；T1其次，降解率為7.78%；CK最少，降解率為4.21%。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降19.26%和25.27%，均較CK(5.61%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，NNN含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降28.15%、35.23%和7.02%，T2下降最多，T1次之。

總體看，T1對(duì)B2F和C3F煙葉NNN的降解效果最好，對(duì)X2F的降解效果次于T2；2種微生物的降解效果集中在發(fā)酵后10～15 d，最佳發(fā)酵時(shí)間為15 d。

2.2.2 4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK) 從圖3看出，3個(gè)部位煙葉的NNK含量隨不同微生物發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈慢快慢下降趨勢(shì)。

1) B2F。發(fā)酵10 d時(shí)各處理煙葉的NNK含量下降4.29%～29.41%，T1下降最多，T2其次，降解率為26.23%，CK最少。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降60.78%和59.57%，均較CK(5.26%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，NNK含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降63.73%、65.68%和8.38%，T2下降最多，T1次之。

2) C3F。發(fā)酵10 d時(shí)各處理煙葉的NNK含量下降3.59%～11.86%，T1下降最多，T2其次，降解率為11.61%，CK最少。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降54.55%和32.21%，均較CK(5.98%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，T1的NNK含量呈緩慢下降趨勢(shì)，而T2的NNK含量仍呈快速下降趨勢(shì)；至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降58.50%、55.43%和7.97%，T1下降最多，T2次之。

3)X2F。發(fā)酵10 d時(shí)各處理煙葉的NNK含量下降2.16%～9.04%，T1下降最多，T2其次，降解率為4.44%，CK最少。發(fā)酵10～15 d時(shí)T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時(shí)T1和T2較0 d時(shí)分別下降27.68%和32.22%，T2的降速超過T1，均較CK(5.94%)降解快。發(fā)酵15～20 d時(shí)，NNK含量又恢復(fù)緩慢下降趨勢(shì)，至20 d時(shí)，T1、T2和CK較0 d時(shí)分別下降33.33%、41.67%和7.57%，T2下降最多，T1次之。

總體看，T2對(duì)B2F和X2F煙葉NNK的降解效果最好，對(duì)C3F的降解效果次于T1；2種微生物的降解效果集中在發(fā)酵后10～15 d，最佳發(fā)酵時(shí)間為15 d。

3 討論

口含煙是煙草以粉末形式在口腔中使用，煙草的煙堿等成分溶出后通過口腔黏膜吸收。因直接入口腔，口含煙對(duì)煙草原料品質(zhì)安全要求苛刻，其品質(zhì)直接決定口含煙產(chǎn)品的風(fēng)味特色和使用安全性。而一般新烤的煙葉具有很重的青雜氣，煙堿含量大、刺激性高，且含有對(duì)人體健康造成不良影響的煙草特有亞硝胺。目前已可以使用發(fā)酵醇化技術(shù)改進(jìn)上述缺陷。單宏英等[17-19]分別證明熒光假單胞菌AS97、銅綠假單胞菌和短小芽孢桿菌均可顯著降低煙草的TSNA含量。趙麗萍等[20]從62個(gè)煙葉樣品中分離篩選出1株能以煙堿作為碳氮源和能源的11L140巴氏微桿菌，其具有明顯的降堿功能。該研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均具有降煙堿和特有亞硝胺的作用，與前人的研究結(jié)果類似。解淀粉芽孢桿菌GUHP86的降解效果較枯草芽孢桿菌B01好，可能是GUHP-86發(fā)酵煙葉時(shí)生成了具納豆激酶活力和蛋白酶活力等對(duì)人體有益的酶[27]，起到促進(jìn)煙堿降解的作用。不同部位降解率不一樣，可能是因?yàn)槠鋬?nèi)涵物質(zhì)及含量不同，也可能是因?yàn)闊煵葜刑赜衼喯醢放c煙堿含量呈極顯著正相關(guān)[28-29]，具體還有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均具有一定的降煙堿作用，發(fā)酵20 d時(shí)，解淀粉芽孢桿菌GUHP86對(duì)不同部位煙葉煙堿的降解率存在差異，表現(xiàn)為B2F(50.78%)>C3F(40.89%)>X2F(19.46%)，枯草芽孢桿菌B01降解效果次于GUHP86，其對(duì)不同部位煙葉的降解率也不同，表現(xiàn)為B2F(44.36%)>C3F(38.43%)>X2F(15.00%)。解淀粉芽孢桿菌GUHP86降煙堿的效果較枯草芽孢桿菌B01好，2種微生物最佳發(fā)酵時(shí)間為10～15 d；發(fā)酵15 d時(shí)，2種微生物對(duì)不同部位煙葉煙堿的降解率分別為X2F 17.30%和11.11%，C3F 38.14%和33.81%，B2F 44.04%和40.00%。

解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均能降低煙草原料的特有亞硝胺NNN和NNK含量，GUHP86對(duì)NNN的降解率表現(xiàn)為B2F(64.39%)>C3F(56.73%)>X2F(28.15%)，B01對(duì)NNN的降解率表現(xiàn)為B2F(55.60%)>C3F(54.86%)>X2F(53.23%)；GUHP86對(duì)NNK的降解率表現(xiàn)為B2F(63.73%)>C3F(59.28%)>X2F(33.33%)，B01對(duì)NNK的降解率表現(xiàn)為B2F(65.68%)>C3F(55.43%)>X2F(41.67%)，表明，GUHP86和B01對(duì)B2F特有亞硝胺NNN和NNK的降解率最高，C3F次之，X2F最低，降解效果最好的時(shí)間段為發(fā)酵后10～15 d，發(fā)酵15 d時(shí)，2種微生物對(duì)不同部位煙葉NNN的降解率分別為B2F 51.49%和42.98%，C3F 54.27%和44.31%，X2F 19.26%和25.27%，GUHP86對(duì)B2F和C3F煙葉NNN的降解效果較B01好，對(duì)X2F的降解效果次于B01；NNK降解率分別為B2F 60.78%和59.57%，C3F 54.55%和32.21%，X2F 27.68%和32.22%，B01對(duì)B2F和X2F煙葉NNK的降解效果較GUHP86好，對(duì)C3F的降解效果次于GUHP86。