茶渣纖維素水凝膠固定化酶的研究

晉 豆，羅藝獻(xiàn)，顧蘇宜，黃建忠，祁 峰

茶渣纖維素水凝膠固定化酶的研究

晉 豆，羅藝獻(xiàn)，顧蘇宜，黃建忠，祁 峰

（1. 福建師范大學(xué) 工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117； 2. 福建師范大學(xué) 細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108）

采用不同目數(shù)的茶渣制備茶渣纖維素微纖絲水凝膠（TW-CNFs/hydrogels），將其作為微載體固定米根霉脂肪酶（ROL）和米曲霉α-淀粉酶（AOA）。通過掃描電鏡（SEM）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）、對(duì)脂肪酶和淀粉酶及載體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析等表征，結(jié)果表明：茶渣纖維素微纖絲表面存在大量蜂窩狀的空隙，當(dāng)茶渣纖維素微纖絲水凝膠被制成后，在空間分布上還帶有明顯的不規(guī)則和聚集堆疊的特性，酶分散和固定在各個(gè)空隙和堆疊的空間內(nèi)；載體中茶渣的濃度越高，制備的茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的酶活性越高；當(dāng)pH為10時(shí)，已固定脂肪酶活性達(dá)到最高值，而游離脂肪酶的酶活降低85%左右；當(dāng)pH為10時(shí)，固定淀粉酶的酶活比游離淀粉酶的高50%以上。相比游離酶，茶渣纖維素微纖絲水凝膠上固定的酶最適pH都向堿性偏移，說明固定化酶更具有耐堿性，pH穩(wěn)定性和極端環(huán)境耐受性有顯著性提高。

固定化酶；茶渣纖維素微纖絲；水凝膠；米根霉脂肪酶；米曲霉α-淀粉酶

近年來，利用茶渣纖維素制作水凝膠的各種應(yīng)用引起了人們的極大興趣，Huihua H等將茶渣利用離子液體進(jìn)行處理，通過加入殼聚糖、天然大分子聚合物等添加物的方式，提高茶葉纖維素復(fù)合水凝膠的熱穩(wěn)定性、力學(xué)性能、載藥率與藥物釋放率。另外研究還表明，含κ-卡拉膠、瓜爾膠和可溶性淀粉等添加物的茶渣水凝膠材料載體，具有細(xì)胞毒性低與較好的細(xì)胞相容性等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。除此之外，Zhijun L等利用堿性化學(xué)法從不同嫩度的茶渣中提取纖維素，將茶渣纖維素進(jìn)行改性后制備成茶渣纖維素水凝膠，研究發(fā)現(xiàn)成熟葉纖維制備的水凝膠對(duì)于水楊酸鈉的載藥率與釋放率最高[3-4]。

聚合物水凝膠會(huì)構(gòu)成一個(gè)交聯(lián)的三維親水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在聚合物鏈內(nèi)保留水相，為酶提供一個(gè)適宜的生理環(huán)境，有利于維持酶構(gòu)象，并協(xié)助執(zhí)行酶的催化功能。近年來各種復(fù)合水凝膠材料已經(jīng)被利用開發(fā)為酶固定化的載體。Bilal M 等開發(fā)一種瓊脂糖-殼聚糖聚合物混合水凝膠，用于固定化辣根過氧化物酶，該研究使辣根過氧化物酶具有更廣的工作pH和溫度穩(wěn)定性，以及高的回收效率[5]。Jang E等先通過共價(jià)結(jié)合葡萄糖氧化酶于二氧化硅納米顆粒表面，再通過水凝膠包埋結(jié)合來固定化酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過這種方式固定化酶會(huì)大大提高酶的穩(wěn)定性及重復(fù)利用性[6]。Huihua H等利用含磁性四氧化三鐵的茶纖維素水凝膠固定木瓜蛋白酶，此種固定方法使木瓜蛋白酶對(duì)磁場敏感，且具有順磁性與較高的熱穩(wěn)定性[7]。復(fù)合水凝膠材料具有合成方便、環(huán)保、成本效益高等顯著性能，所以作為固定化載體材料具有巨大的應(yīng)用潛力，人們對(duì)其研究和應(yīng)用越來越感興趣[8-9]。

在現(xiàn)有技術(shù)啟發(fā)下，制成了以茶渣為原料的纖維素微纖絲（cellulose nanofibrils, CNFs）基水凝膠，并對(duì)固定化酶效果進(jìn)行了初步研究，研究將脂肪酶和淀粉酶固定在茶渣纖維素水凝膠上，構(gòu)建一種新的固定化酶模式，既可以提高資源利用率，同時(shí)又有利于提高酶的穩(wěn)定性和可循環(huán)性，是一種具有巨大工業(yè)應(yīng)用潛力的固定化酶方式。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

茶渣購自福建仙洋洋生物科技有限公司、無水硫酸鈣（CaSO4）購自阿拉丁化學(xué)有限公司、聚乙烯醇（PVA）購自Sigma-Aldrich公司、海藻酸鈉購自上海麥克林生化科技有限公司、實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 蛋白含量測定

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：測定固定化酶固定后的殘余蛋白含量采用的是Bradford法[10]，其原理是在酸性溶液中考馬斯亮蘭G-250染液能與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變?yōu)?95 nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測定的A595吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。

脂肪酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：為了使脂肪酶的三個(gè)濃度（5、25和250 μg/mL）的吸光值都能落在蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，制作了脂肪酶的三個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程分別是1＝0.002 6＋0.322，2＝0.020 9－0.058 2，3＝0.013 7＋0.019。

淀粉酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：曲線方程是3＝0.013 7＋0.019，2＝0.998 6。

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為＝0.039 8＋0.207 1，2＝0.995 9，式中，y是pNP在波長410 nm處吸光值，為pNP濃度（μmol/L）。

蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，首先用酶標(biāo)儀測在595 nm 處的吸光度值，根據(jù)吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)蛋白濃度（μg/mL）計(jì)算出待測酶液的酶濃度，從而得出固定化效率，如式（1）所示。

1.2.2 酶活測定

脂肪酶酶活測定采用對(duì)硝基苯酚法[11]來測定脂肪酶酶活性，此法的原理是通過脂肪酶催化反應(yīng)將底物p-NPP水解后生成對(duì)硝基苯酚，在堿性條件下，對(duì)硝基苯酚在410 nm處有最佳吸光度，通過吸光度的大小可以推測出對(duì)硝基苯酚的濃度。因此，將測定p-NP酯底物p-NPL（C12）轉(zhuǎn)化成測量對(duì)硝基苯酚（p-NP）的釋放量，測定游離脂肪酶的酶活性，如式（2）所示。

脂肪酶酶活力公式：

式中，為脂肪酶酶活力U /（1 mL脂肪酶酶液），為pNP濃度（μmol/L），1為反應(yīng)液總體積（mL），為酶液稀釋倍數(shù)，為反應(yīng)時(shí)間（min），2為酶液體積（mL）。

淀粉酶酶活測定采用3-5-二硝基水楊酸法[12]測定α淀粉酶酶活性。等體積的淀粉溶液內(nèi)加入等體積不同濃度的淀粉酶，在25℃下靜置10分鐘，與分解出來的還原糖充分反應(yīng)。然后分別加入1 mL DNS，立即置于沸水浴中反應(yīng)5 min，采用分光光度計(jì)測定540 nm處吸光度以及麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。淀粉酶酶活性的單位定義是在25℃條件下，每分鐘釋放1 μmol麥芽糖所需的酶量，如式（3）所示。

淀粉酶酶活力計(jì)算公式：

式中，?1為樣品管與空白管的吸光值之差，?2為標(biāo)準(zhǔn)管與標(biāo)準(zhǔn)空白管的吸光值之差，為標(biāo)準(zhǔn)管中麥芽糖的物質(zhì)的量（μmol），為樣品管中酶的質(zhì)量（mg）。

1.2.3 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的制備

1.2.3.1 纖維素微纖絲預(yù)處理

用雙蒸水將茶渣清洗干凈并烘干，將茶渣表面上的灰塵以及一些雜質(zhì)去除。將茶渣用粉碎機(jī)粉碎10分鐘，重復(fù)操作該過程，待茶渣徹底粉碎成細(xì)末狀。用35目、100目和300目的篩網(wǎng)分別過篩得到相應(yīng)的級(jí)別的纖維素微纖絲，將茶渣預(yù)處理得到的纖維素微米纖維稱為茶渣纖維素微纖絲。

1.2.3.2 茶渣纖維素微纖絲水凝膠的制備

在Liu S L[13]文獻(xiàn)基礎(chǔ)上操作方法改進(jìn)為：稱取分別為5%（wt）、10%（wt）的茶渣纖維素微纖絲，制備均勻混合的茶渣纖維素微纖絲、0.5% PVA和海藻酸鈉懸濁液，加入到分液漏斗中，使其緩慢滴入CaSO4溶液中得到凝膠小球，然后篩選大小形狀均勻的小球，再進(jìn)一步硬化茶渣纖維素微纖絲水凝膠小球。將制備得到的茶渣纖維素微纖絲水凝膠放入4℃冰箱保存。

1.2.3.3 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶

在Luo Y X[14]文獻(xiàn)基礎(chǔ)上操作方法改進(jìn)為：將其SiO2微載體替換成茶渣纖維素微纖絲水凝膠，選取每組大小均勻的6個(gè)凝膠球，進(jìn)行交聯(lián)劑雙環(huán)氧試劑新戊二醇二縮水甘油醚（NGDED）交聯(lián)，選取不同濃度的脂肪酶（ROL）和淀粉酶（AOA）加入未進(jìn)行交聯(lián)劑活化和已進(jìn)行交聯(lián)劑活化的茶渣纖維素微纖絲水凝膠中孵育，得到固定酶的載體水凝膠洗滌后，保存于4℃冰箱備用。

1.2.4 固定化酶表征

掃描電子顯微鏡（SME）、透射電鏡（TEM），將35目（A）、100目（B）和300目（C）茶渣纖維素微纖絲水凝膠粉碎干燥，進(jìn)行觀察研究；傅里葉變換紅外光度計(jì)（FT-IR），將純水凝膠、茶渣纖維素微纖絲水凝膠及固定上酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠微球干燥后以溴化鉀壓片進(jìn)行預(yù)處理，分辨率為1 cm-1，掃描范圍為400～4000 cm-1，進(jìn)行觀察研究。

1.2.5 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

1.2.5.1 交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶酶活的影響

為了評(píng)價(jià)不同濃度交聯(lián)劑的茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶對(duì)于酶活的影響，將制備好的已進(jìn)行交聯(lián)劑活化的茶渣纖維素微纖絲水凝膠催化反應(yīng)，測定酶活力，以最高酶活數(shù)據(jù)為100%酶活力，探討有無交聯(lián)劑情況下的酶活力變化。

1.2.5.2 固定化酶的最適pH

測定pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12下固定化酶步驟得到的已固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠與游離酶脂肪酶（ROL）和淀粉酶（AOA）的酶活力，以最高酶活數(shù)據(jù)為100%酶活力，探討在不同pH下的酶活力變化。

1.2.5.3 固定化酶的pH穩(wěn)定性

pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時(shí)將已固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠與游離酶脂肪酶（ROL）和淀粉酶（AOA）溫育3 h，以最高酶活數(shù)據(jù)為100%酶活力，探討在不同pH酶的穩(wěn)定性。

1.2.5.4 固定化酶的重復(fù)利用性

為了評(píng)價(jià)已固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠可重復(fù)使用性，將固定化的脂肪酶（ROL）和淀粉酶（AOA）進(jìn)行重復(fù)催化反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。將固定化的茶渣纖維素微纖絲水凝膠直接除去上清進(jìn)行分離，每個(gè)循環(huán)后用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三遍，然后進(jìn)行下一批次的反應(yīng)。以第一次酶活數(shù)據(jù)為100%酶活力，探討固定化酶的重復(fù)使用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶渣纖維素微纖絲固定化酶的表征

2.1.1 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的SEM結(jié)果

圖1是三種含或不含茶渣纖維素微纖絲的水凝膠的外貌形態(tài)圖，從圖中可以看出，不含茶渣纖維素微纖絲的水凝膠是呈透明的白色小球，大小均一；含5%茶渣纖維素微纖絲水凝膠小球表面光滑，大小均一分散；而含10%茶渣纖維素微纖絲水凝膠小球表面有些粗糙，大小比5%茶渣纖維素微纖絲水凝膠的小球稍微大一些，顏色也更深，這是含茶渣纖維素微纖絲濃度不同所致。

圖1 三種水凝膠的外貌圖

如圖2a～3c分別是粉碎成35目、100目和300目的茶渣纖維素微纖絲的掃描電鏡圖，可以看出，茶渣纖維素微纖絲表面粗糙，其主體明顯呈現(xiàn)顆粒狀，含有大量排列的蜂窩形狀的大孔結(jié)構(gòu)，而且在空間分布上還帶有明顯的不規(guī)則和聚集堆疊的特性，從結(jié)果上來看，這明顯增加了茶渣纖維素微纖絲的高表面積。高表面積會(huì)增加茶渣纖維素微纖絲載體上官能團(tuán)的數(shù)量，從而提高酶吸附效率。

圖2 茶渣纖維素微纖絲的掃描電鏡圖

2.1.2茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的TEM

為了獲得清晰的茶渣纖維素微纖絲水凝膠輪廓，利用透射電鏡觀察了分散的已固定化酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠。如圖3a～3c分別是35目、100目和300目的茶渣纖維素微纖絲固定化酶的透射電子顯微鏡圖。從圖3可以看出，茶渣纖維素微纖絲表面有很多凹凸結(jié)構(gòu)，其較大的比表面積和孔隙率，使其具有良好的吸附能力。推測圖中箭頭所指部分可能是酶和茶渣微粒的聚集體，酶的聚集體牢固地吸附在茶渣纖維素微纖絲的縫隙中，從而提高了酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。

圖3 茶渣纖維素微纖絲固定化酶的透射電子顯微鏡

2.1.3 傅里葉遠(yuǎn)紅外光譜（FT-IR）分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，由圖4的固定脂肪酶的5%茶渣纖維素微纖絲水凝膠（ROL@5% TW-CNFs/hydrogels）以及固定淀粉酶的5%茶渣纖維素微纖絲水凝膠（AOA@5 % TW-CNFs/hydrogels）的紅外光譜圖可以看出，在3350 cm-1處有一個(gè)較寬的吸收峰可能是纖維素的羥基（-OH）伸縮振動(dòng)引起的，在2860 cm-1和2990 cm-1處的吸收峰是甲基、亞甲基中C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1640 cm-1處有N=O的振動(dòng)峰，在1040 cm-1處可能是C-O的伸縮振動(dòng)峰，這是因?yàn)椴柙w維素微纖絲的分子結(jié)構(gòu)中自身存在（C-2或C-3）的C-O鍵和伯醇（C-6）的C-O鍵，這與先前報(bào)道的纖維素特征峰分析一致[15]。說明脂肪酶已成功吸附到茶渣纖維素微纖絲水凝膠上了。此外，AOA@5%茶渣纖維素微纖絲水凝膠在1640 cm-1處也有N=O明顯的伸縮振動(dòng)峰，而在游離酶（hydrogels）或已經(jīng)固定脂肪酶和淀粉酶的水凝膠（ROL/AOA@hydrogels）的紅外光譜圖中相對(duì)應(yīng)的位置并未見到明顯的N=O的振動(dòng)峰，說明淀粉酶和脂肪酶的氨基與茶渣纖維素微纖絲水凝膠載體表面的羥基通過共價(jià)結(jié)合了，而水凝膠因?yàn)椴缓胁柙w維素微纖絲，表面沒有能與酶的氨基共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)。

圖4 傅里葉紅外光譜分析

圖5 不同新戊二醇二縮水甘油醚濃度交聯(lián)2%茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化淀粉酶

2.2 固定化酶的條件優(yōu)化

2.2.1 交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶酶活的影響

酶與茶渣纖維素微纖絲水凝膠結(jié)合是茶渣上的羥基與酶分子表面的氨基結(jié)合；利用交聯(lián)劑結(jié)合酶的機(jī)制是交聯(lián)劑新戊二醇二縮水甘油醚的環(huán)氧基茶渣纖維素微纖絲水凝膠結(jié)合是茶渣上的羥基結(jié)合，然后新戊二醇二縮水甘油醚的羥基再與酶分子的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。以2%茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化淀粉酶為例，分別用不同濃度的交聯(lián)劑雙環(huán)氧試劑新戊二醇二縮水甘油醚（0.5%、1%、1.5%）先交聯(lián)載體2%茶渣纖維素微纖絲水凝膠，得到的交聯(lián)載體再固定化淀粉酶，然后探討交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶酶活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著交聯(lián)劑的濃度提高，其相對(duì)應(yīng)的酶活性越低，即酶活測定結(jié)果交聯(lián)劑濃度1.5%＜1%＜0.5%，而對(duì)照組游離酶的酶活僅次于0.5%的?？梢酝茢嘣斐蛇@樣的原因，首先與可能是2%茶渣纖維素微纖絲水凝膠與酶分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量是有限的，所有位點(diǎn)都結(jié)合后，酶活性即會(huì)達(dá)到最大值。酶與新戊二醇二縮水甘油醚結(jié)合的位點(diǎn)與水凝膠結(jié)合位點(diǎn)相同，當(dāng)新戊二醇二縮水甘油醚濃度達(dá)到0.5%時(shí)，新戊二醇二縮水甘油醚與茶渣纖維素微纖絲水凝膠上所有位點(diǎn)都結(jié)合，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩組酶活基本相同。然而隨著新戊二醇二縮水甘油醚濃度的增大，酶活性降低。推測原因可能是過高的交聯(lián)劑濃度會(huì)度會(huì)阻斷茶渣纖維素微纖絲水凝膠表面的結(jié)合位點(diǎn)，甚至?xí)茐拿傅幕钚灾行?，致使酶失活變性[16]。而沒有交聯(lián)劑的酶活和0.5%交聯(lián)劑濃度的酶活差不多，因此，考慮到交聯(lián)劑會(huì)一定的有毒性及會(huì)降低固定化酶的酶活，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用無添加交聯(lián)劑進(jìn)行固定化。

2.2.2 不同茶渣纖維素微纖絲濃度對(duì)固定化酶的影響

以固定淀粉酶為例，分別用不同淀粉酶濃度（5、25、250 μg/mL）固定在含不同濃度的茶渣纖維素微纖絲水凝膠表面上，探討不同茶渣纖維素微纖絲濃度的茶渣纖維素微纖絲水凝膠對(duì)固定化酶的影響。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，從圖6可以看出，隨著茶渣纖維素微纖絲的量越高，其相對(duì)應(yīng)的酶活性也越高；此外，已固定茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活性也會(huì)隨酶濃度增加而升高。說明隨茶渣纖維素微纖絲的濃度增加，其水凝膠表面含的羥基就越多，越容易與酶發(fā)生結(jié)合，從而使酶活性升高。然而，當(dāng)茶渣纖維素微纖絲濃度越高時(shí)，形成的水凝膠形狀會(huì)受到一定的牽引力難以形成球狀，因此，使用5%已固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠和10%已固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠進(jìn)行繼續(xù)研究。

圖6 不同茶渣纖維素微纖絲濃度固定化淀粉酶

2.3 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的最適pH

將游離酶與已經(jīng)固定脂肪酶和淀粉酶的水凝膠及不同濃度茶渣纖維素微纖絲的已經(jīng)固定脂肪酶和淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠置于pH為3、5、7、9、10、11的緩沖液中與底物進(jìn)行反應(yīng)，然后測定其酶活。從圖7a可以看出，在pH為3～9時(shí)，游離脂肪酶的酶活高于已經(jīng)固定脂肪酶的水凝膠和兩種已經(jīng)固定脂肪酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活，這可能是由于茶渣纖維素微纖絲水凝膠載體具有高度的pH敏感性，在低pH溶液時(shí)茶渣纖維素微纖絲水凝膠載體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)收縮從而使底物與酶的接觸通道關(guān)閉，所以酶反應(yīng)的進(jìn)行就減慢了[17]。當(dāng)pH為9時(shí)，已經(jīng)固定脂肪酶的水凝膠和兩種已經(jīng)固定脂肪酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活與游離脂肪酶的酶活相差不大，而游離脂肪酶的酶活性達(dá)到最高值，隨后一直降低，說明游離脂肪酶的最適pH為9；而當(dāng)pH為10時(shí)，已經(jīng)固定脂肪酶的水凝膠和兩種已經(jīng)固定脂肪酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活性達(dá)到最高值，而游離脂肪酶的酶活降至85%左右，且固定化酶的酶活在pH為10～11環(huán)境中都始終高于游離脂肪酶，說明茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化脂肪酶可以有效提高其作用pH范圍。上述結(jié)果與先前報(bào)道的結(jié)果相似，他們通過調(diào)控微晶纖維素顆粒到20～200 nm范圍，在有機(jī)溶劑中固定脂肪酶，結(jié)果表明在pH＝10條件下，固定化脂肪酶具有最佳活性，在堿性條件下比可溶性酶更穩(wěn)定[18]。同樣，在圖7b中，已經(jīng)固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活性的最適pH也都是10，與游離淀粉酶最適pH為5相比，固定化酶的最適pH為10，這大大增加了淀粉酶的最適pH，增強(qiáng)了固定化淀粉酶的耐堿性。然而，游離淀粉酶經(jīng)過固定后，在pH范圍為5～9內(nèi)的酶活性有一定的波動(dòng)，而游離淀粉酶的酶活高于已經(jīng)固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活，原因可能與上述一樣，水凝膠載體的特殊結(jié)構(gòu)在低pH溶液中減慢酶與底物的反應(yīng)，并且經(jīng)過有載體的包裹，可以使酶分子的堿敏感度降低。同樣，在pH為10以上時(shí)，已經(jīng)固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活都比游離淀粉酶的高50%以上，說明制備的已經(jīng)固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠適合在強(qiáng)堿性環(huán)境中進(jìn)行催化反應(yīng)。這些結(jié)果與溶菌酶在細(xì)菌纖維素微米纖維（BCNFs）上的物理吸附固定一致，也是導(dǎo)致其最佳pH的增加，說明在纖維素微纖絲上固定化酶可以增加其最適pH，進(jìn)一步增強(qiáng)酶的耐堿性[19]。

圖7 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化脂肪酶（a）和固定化淀粉酶（b）的最適pH

2.3.2 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的pH穩(wěn)定性

將游離酶和已經(jīng)固定酶的水凝膠及已經(jīng)固定酶的含不同濃度茶渣纖維素微纖絲的水凝膠置于pH為3、5、7、9、10、11的緩沖液中孵育3小時(shí)后與底物進(jìn)行反應(yīng)，然后測定其酶活，以未在緩沖液中孵育過已經(jīng)固定酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的酶活為初始酶活。從圖8a可以看出，不含茶渣纖維素微纖絲的水凝膠及含不同濃度茶渣纖維素微纖絲的水凝膠的pH穩(wěn)定性明顯比游離脂肪酶的好，而已經(jīng)固定脂肪酶的水凝膠的相對(duì)酶活保持在80%左右，無論在酸性還是堿性條件下，被固定化的脂肪酶都比游離脂肪酶的相對(duì)酶活高，說明水凝膠和茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化脂肪酶可以有效提高其pH穩(wěn)定性。

同樣，從圖8b也可以看到，固定淀粉酶的水凝膠和兩種固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠的pH穩(wěn)定性都比游離淀粉酶的高，而且當(dāng)pH為10時(shí)游離淀粉酶的酶活性都降至20%以下，未含茶渣的固定淀粉酶的水凝膠在pH為9時(shí)也急劇下降，且當(dāng)pH為10已經(jīng)下降至30%，但固定淀粉酶的茶渣纖維素微纖絲水凝膠仍可以保持在110%以上的酶活力。說明增加了茶渣微米纖維的水凝膠結(jié)構(gòu)可以起到對(duì)酶分子的保護(hù)作用，而水凝膠載體與淀粉酶之間的相互作用能夠增加其pH穩(wěn)定性。一些研究已經(jīng)證明在大多數(shù)情況下，與游離酶相比，將酶固定在微米有機(jī)或微米雜化材料上其pH的穩(wěn)定性會(huì)增加[20]。而纖維素基水凝膠是一種有機(jī)微米雜化材料，其特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)酶固定化的穩(wěn)定性會(huì)顯著提高。

圖8 茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化脂肪酶（a）和固定化淀粉酶（b）的pH穩(wěn)定性

3 結(jié)論

茶渣纖維素微纖絲水凝膠是一個(gè)含有很多無序空隙的球體。為了研究茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化酶的可行性，制成了茶渣纖維素微纖絲含量為5%和10%的水凝膠作為酶的載體。脂肪酶和淀粉酶可以在不存在交聯(lián)劑的情況下有效連接和固定在茶渣纖維素微纖絲水凝膠上。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出茶渣微米纖維素水凝膠上固定的酶最適pH都向堿性偏移了，說明利用茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定化的酶更具有耐堿性，極端環(huán)境耐受性有顯著性提高；除此之外茶渣纖維素微纖絲水凝膠固定脂肪酶和淀粉酶的pH穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性也均有提高。綜上所述茶渣纖維素微纖絲水凝膠可以作為一種理想且容易獲得的材料應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域。

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Study of Tea Waste Nanofibrils Cellulose Hydrogel for Enzyme Immobilization

JIN Dou, LUO Yi-xian, GU Su-yi, HUANG Jian-zhong, QI Feng*

（1. National and Local Joint Engineering Research Center for Industrial Microbial Fermentation Technology, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China;2. Fujian Provincial Key Laboratory of Cell Stress Response and Metabolic Regulation, Fujian Normal University,Fuzhou 350108, China）

Tea waste cellulose nanofibrils hydrogels (TW-CNFs/ Hydrogels) were pre-constructed by various mesh sizes of tea waste and then utilized them as nanofibrils for immobilize Rhizopus oryzae’s lipase (ROL) and Aspergillus oryzae’s α-amylases (AOA). To characterize the lipase, amylase and the carrier, we utilize the scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared (FT-IR) for morpheological analysis. The results showed that: There is a large number of honeycomb pores on the surface of the tea waste cellulose nanofibrils. Whentea waste cellulose nanofibrils hydrogels is aggregated, the spatial distribution of tea waste cellulose nanofibrils hydrogel had obvious characteristics with irregularity and stacking and the enzyme is dispersed and fixed in each and stacking space. The higher the concentration of tea residue from the carrier, the higher the enzyme activity of the prepared tea waste cellulose nanofibrils hydrogel immobilized. When pH was 10, the activity of fixed lipase reached the highest value, while the activity of free ratios decreased by about 85%. At pH 10, the enzymatic activity of fixed amylase was more than 50% higher than that of free amylase. Compared with the free enzyme, the optimal pH of the enzyme fixed on the tea waste cellulose nanofibrils hydrogel shifted to alkaline, indicating that the immobilized enzyme was more alkaline resistant and the pH stability and extreme environmental tolerance were improved significantly.

immobilized enzyme; tea waste cellulose nanofibril; hydrogel; Rhizopus oryzae’s lipase; Aspergillus oryzae’s α-amylases

1004-8405(2022)03-0011-10

10.16561/j.cnki.xws.2022.03.06

2022-08-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32272287）。

晉 豆（1996～），女，碩士；研究方向：生物材料工程。

通訊作者：祁峰（1980～），男，教授；研究方向：主要研究方向?yàn)榇x工程和生物材料工程。f.qi@fjnu.edu.cn

Q814.2

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