葛根素對肥胖相關基因NPY、POMC和NMU表達的影響

江道合，江青東

(1.河南正陽縣畜牧技術服務中心，河南 正陽 463600； 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 畜產(chǎn)品質量安全技術研究院，河南 鄭州 450046)

葛根素化學名為4,7-二羥基-8-β-D葡萄糖異黃酮，是從豆科植物野葛根中提取的單體,對動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、高血脂、高血壓、糖尿病等疾病有一定的預防作用和治療效果[1]。神經(jīng)介素U受體對動物攝食和能量代謝具有重要的調節(jié)作用[2]。神經(jīng)介素U主要分布在動物下丘腦腹內(nèi)側核和尾側腦干區(qū)域，其受體主要分布在下丘腦的室旁核，這些區(qū)域是動物攝食和能量代謝的主要調控區(qū)[3]。通過對大鼠腦室注射神經(jīng)介素U后可大大降低大鼠采食量并使其體重減輕，但對大鼠腦室注射神經(jīng)介素U抗體后，大鼠采食量和體重都增加[3]。神經(jīng)介素U受體基因敲除或封閉的大鼠，在自由采食的情況下，其體重也有所增加，表明神經(jīng)介素U與其受體結合后，對動物采食和能量代謝具有調節(jié)作用[4,5]。本試驗通過對肥胖大鼠下丘腦灌注葛根素，研究葛根素對神經(jīng)介素U2受體基因(NMU2R)、神經(jīng)介素U基因(NMU)、前皮質素原基因(POMC)、神經(jīng)肽Y基因(NPY)等肥胖相關基因表達水平的影響，探討葛根素的減肥機制。

1 試驗材料與方法

1.1 主要試劑

葛根素由中國食品藥品檢定研究院提供。氯仿、乙酸鈉、EDTA、瓊脂糖等均購自武漢博士德生物工程有限公司。TRIZOL、100bp DNA Ladder、TaqDNA酶、MOPS、溴化乙錠、RNA酶抑制劑、MMLV反轉錄酶、Oligo (dT)、Taq聚合酶均購自Sigma公司。

1.2 主要儀器

DK-8D型電熱恒溫水槽、THZ-C型恒溫振蕩器、LG-微波爐、DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、H6-1微型電泳槽、YXJ-2離心機均為格科微電子(上海)有限公司產(chǎn)品。Ferotec Gradien PCR基因擴增儀為Sigma公司產(chǎn)品。Rotor-Gene 3000 ReaLtime PCR儀為Corbett Research公司產(chǎn)品。凝膠成像系統(tǒng)為Gene Genius公司產(chǎn)品。U-3010紫外可見分光光度計為Hitachi公司產(chǎn)品。

1.3 試驗動物及分組

選取體重250 g左右的SD雄性大鼠40只，隨機分為4組：正常對照組、模型對照組(腦室注射生理鹽水，5 μL/只)、低劑量葛根素組(腦室注射葛根素，5 μL/只)、高劑量葛根素組(腦室注射葛根素，10 μL/只)。鼠飼料由河南省實驗動物中心提供，自由采食和飲水。試驗期42天。

1.4 RNA提取與純化

大鼠麻醉抽血后，快速取出腦組織并分離下丘腦，置于液氮中。取500 mg下丘腦組織于勻漿器中，然后加入5 mL TRIZOL進行勻漿，將勻漿后的樣品吸入離心管中，置于恒溫孵育箱中25 ℃孵育10 min，孵育后吸取1 mL勻漿液置入2.5 mL新離心管中，加入氯仿0.5 mL，劇烈振蕩20 s，然后25 ℃孵育5 min，4 ℃ 12 000 g離心15 min，取上清液于2.5 mL離心管中，加入異丙醇1 mL，混勻后于25 ℃ 孵育10 min，4 ℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，加入2.5 mL 75%乙醇，4 ℃ 7 500 g 離心8 min，棄上清。RNA沉淀在空氣中干燥3 min。分光光度計檢測RNA溶液的OD260/OD280。

凝膠電泳。稱取2.5 g瓊脂糖，溶于250 mL DEPC水中，加熱至完全溶解，室溫冷卻。取10 mL 10×MOPS電泳緩沖液和20 mL甲醛溶液制膠，將制好的凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入足夠量的電泳緩沖液。取100 μL RNA和400 μL甲醛，用配制好的EB溶液調配至終濃度(質量濃度)10 μg /mL，65 ℃孵育15 min，6 V/cm電壓下電泳，紫外透射光拍照。

cDNA合成。取5 μL MMLV反轉錄酶、5 μL RNA酶抑制劑、20 μL 2.5 mM dNTP混合液、20 μL 5×RT緩沖液，混合均勻后37 ℃水浴10 min。取10 μL RNA、2 μL 3.5 μM Oligo(dT)引物、18 μL無RNA酶蒸餾水，混合均勻后65 ℃水浴6 min，37 ℃水浴10 min。取15 μL RT反應液和15 μL退火混合液于離心管中，36.5 ℃水浴56 min，95 ℃ 孵育6 min，4 ℃保存待用。

1.5 實時熒光PCR

β-actin:上游引物5′-CCTCTATGCCTCTATGCAACACAGC-3′，下游引物5′ -ATACTCCTGCTTGCTGCTGATGCC-3′。

NMU2R:上游引物5′-GCTTCCTCTTCTACATCTACCTCCA-3′，下游引物5′-CACAGCCACTCCCGTTGTCGCTC-3′。

cDNA合成。10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL，20 μM的PCR特異引物1、引物2各0.5 μL，dNTPs混合液3 μL，Taq聚合酶3 U，cDNA 1 μL，加水至總體積25 μL。溶液混勻后，PCR循環(huán)45個(94 ℃ 20 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。將擴增后的PCR產(chǎn)物分別進行10倍梯度稀釋成7個梯度濃度(1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7)的cDNA。

以7個梯度濃度的cDNA模板分別配制PCR反應體系。2.5 μL 10×PCR緩沖液，3 μL MgCl2溶液，3 μL dNTPs混合液，3 U Taq聚合酶，20 μM PCR特異引物1、2各0.5 μL，1 μL cDNA，加水至總體積為25 μL。溶液混勻后，5000 g離心30 s。

PCR擴增反應條件。β-actin：94 ℃ 5 min，35個PCR循環(huán)(94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)，87 ℃ 10 s。NMU2R：94 ℃ 5 min，35個PCR循環(huán)(94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)，85 ℃ 10 s。

1.6 NMU、NPY及POMC基因表達的半定量PCR檢測

(1)引物設計。β-actin:上游引物5′-CACCCGCGAGTACACACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACTCATCACACC-3′；POMC:上游引物5′-GAACAGCCCTTGAACTGAAAA-3′，下游引物5′-CTTGAAGAGCGTCAACCAGG-3′；NPY:上游引物5′-GCTGTGTGGAACTGACCCTCG-3′，下游引物5′-GGGACAGGCCAGACTGGTTTC-3′；NMU:上游引物5′-ATCTCCTCAATCCTGTCAACTGC-3′，下游引物5′-GTTGACCTCTATCCTCATTGCGT-3′。

(2)PCR擴增反應體系和反應條件分別如表1和表2所示。

表1 PCR擴增反應體系 μL

表2 反應條件

(3)目的基因表達量

用TAE×1配制1.2%瓊脂糖凝膠，恒定電壓90 V進行電泳。目的基因擴增產(chǎn)物灰度值/β-actin基因擴增產(chǎn)物灰度值為目的基因表達量。

2 結果

2.1 RNA提取

RNA凝膠電泳結果顯示，18 S和28 S條帶清晰、無降解(圖1)，OD260/OD280比值為1.8～2.2，說明RNA純度高。

圖1 RNA凝膠電泳圖

2.2 熒光定量PCR

圖2、圖3顯示，NMU2R基因熒光定量PCR產(chǎn)物濃度高，PCR反應體系穩(wěn)定、結果可靠。如表3所示，高劑量葛根素組NMU2R基因表達量顯著高于正常對照組和模型對照組(P<0.05)，低劑量葛根素組NMU2R基因表達量高于高劑量葛根素組(P<0.05)。

表3 葛根素誘導下NMU2R表達變化

圖2 NMU2R動力反應曲線

圖3 β-actin基因動力反應曲線

2.3 半定量PCR

如圖4所示，POMC、NPY、NMU等基因均得到很好的擴增。

圖4 POMC、NPY、NMU基因擴增產(chǎn)物電泳圖

如圖5所示，NPY基因表達在葛根素的誘導下降低(P<0.05)，POMC和NMU基因表達在葛根素的誘導下增加(P<0.05)，說明葛根素的減肥機制與NPY、POMC的表達調控存在一定關聯(lián)性。

圖5 葛根素誘導POMC、NPY、NMU基因表達變化

3 討論

下丘腦富含多種食欲因子，在調節(jié)飲食方面扮演著重要的角色。神經(jīng)介素U存在于下丘腦室旁核的核團中，神經(jīng)介素U與其受體結合，具有抑制食欲、增強能量代謝及減輕體重的作用。神經(jīng)肽Y主要存在于下丘腦弓狀核中，通過外源性注射神經(jīng)肽Y可提高動物的攝食量，增加動物機體的脂肪蓄積[6-9]。NMU轉基因小鼠下丘腦的POMC和NPY基因表達量顯著增加[10]。

本試驗中，葛根素給藥后，下丘腦NMU2R基因表達量顯著增加，葛根素低劑量組顯著高于高劑量組(P<0.05)，表明低劑量葛根素對大鼠的減肥作用效果更好。本試驗發(fā)現(xiàn)，葛根素干預組大鼠下丘腦中POMC基因表達量與NMU轉基因小鼠下丘腦POMC基因表達量表現(xiàn)一致，均呈現(xiàn)高表達[11-15]。NPY基因表達則呈現(xiàn)下降趨勢，這與NMU轉基因小鼠的NPY基因表達相反，其原因可能是NMU2R基因被激活后，引起NPY及POMC基因表達變化，進而調節(jié)神經(jīng)介素U2受體信號通路，使動物產(chǎn)生厭食反應。