高效液相色譜法測(cè)定飼料中的枯草菌肽

單慧燕，劉麗芳，史彥薇，黃好強(qiáng)，向霞霞，蘭尊海

(1.河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，河南 鄭州 450003)

抗生素作為促生長添加劑，可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益[1]，但是隨著抗生素的廣泛使用，其耐藥性和藥物殘留等負(fù)面作用越來越突出。《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第194號(hào)》規(guī)定，自2020年1月起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[2]。尋找抗生素的替代品，開發(fā)安全性好、無藥物殘留、無副作用的藥物添加劑具有重要意義。

枯草菌肽主要作用于革蘭氏陽性細(xì)菌和陰性球菌，對(duì)螺旋體也有較好的抑制作用，可作為一種新型的抗生素替代品?？莶菥臑轭惏咨虻S色的粉末，無臭、味苦，有引濕性，易被氧化劑破壞，在溶液中能被多種重金屬鹽類沉淀[3]?？莶菥脑谒幸兹?，亦可溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿或乙醚。目前枯草菌肽的檢測(cè)方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[4-6]和微生物法[7]。液質(zhì)聯(lián)用法受基質(zhì)的干擾，存在回收率低、離子選擇性差等問題。微生物法受菌株穩(wěn)定性的影響，檢測(cè)結(jié)果不易控制，而且所需的菌株價(jià)格較高。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定飼料中枯草菌肽的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、試劑與供試品

1.1.1 儀器設(shè)備

e2695高效液相色譜儀(Waters)配紫外檢測(cè)器，購自沃特世科技(上海)有限公司。BSA124分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。JW-2019HR高速冷凍離心機(jī)購自安徽嘉文儀器裝備有限公司。HSC-248氮吹儀購自天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。1820V超純水機(jī)購自重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.1.2 試劑

枯草菌肽標(biāo)準(zhǔn)品(TMstandard)。色譜級(jí)三氟乙酸(上海滬試精細(xì)化學(xué)品有限公司)。色譜級(jí)乙腈(天津彪仕奇科技發(fā)展有限公司)。

流動(dòng)相 A(0.1%三氟乙酸)：取1 mL三氟乙酸，用超純水定容至1000 mL，用0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣10 min 后密封保存。流動(dòng)相B(80%乙腈)：量取800 mL乙腈，加超純水定容至1000 mL。用移液器取0.85 mL三氟乙酸，加入到乙腈-水溶液中，用0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣10 min后密封保存。

1.1.3 供試品

陽性飼料樣品為客戶委托的含枯草菌肽的飼料添加劑樣品，陰性飼料樣品為相同基質(zhì)的不含枯草菌肽的飼料添加劑樣品。

1.2 分析步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.2 g枯草菌肽標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加入約70 mL的蒸餾水，超聲處理20～30 min，取出，放至室溫，用蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 飼料樣品溶液配制

準(zhǔn)確稱取陽性飼料樣品5.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入約70 mL的蒸餾水，超聲處理20～30 min，取出，放至室溫，用蒸餾水定容。用0.22 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液1 mL，接濾液于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜柱：C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相A和流動(dòng)相B梯度洗脫(0～15 min時(shí)70∶30，16～25 min時(shí)57∶43，26～30 min時(shí)0∶100，31～35 min時(shí)70∶30)；流速為1.0 mL/min。檢測(cè)波長為280 nm。進(jìn)樣量為20 μL。柱溫為25 ℃。

1.4 結(jié)果計(jì)算

飼料樣品中枯草菌肽的含量按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中:

X—樣品中枯草菌肽的含量，單位為mg/kg；

C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中枯草菌肽的質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；

m—樣品稱樣量，單位為g；

V—樣品的定容體積，單位為mL；

F—樣品的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 線性方程擬合

吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液約1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，過濾液按照1.3項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄目標(biāo)峰的峰面積(表1)。以枯草菌肽的質(zhì)量濃度為自變量，以目標(biāo)峰峰面積為因變量，擬合的線性方程為y=1 827 919.4x-33 109.6，R2=0.999 1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度和目標(biāo)峰峰面積

2.2 精密度試驗(yàn)

吸取0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，過濾液進(jìn)樣檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄枯草菌肽的保留時(shí)間和峰面積值(表2)，二者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.59%和1.64%。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 檢出限試驗(yàn)

吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的溶液。按1.3項(xiàng)中色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算信噪比(表3)。取信噪比≥3時(shí)的質(zhì)量濃度為最低檢出限[8]，最低檢出限為0.005 mg/mL。

表3 檢出限試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

稱取適量的陽性飼料樣品，配制成質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL的供試品溶液，6份。取溶液約1 mL，過0.45 μm微孔濾膜。進(jìn)樣兩針，記錄色譜圖峰面積，根據(jù)線性方程計(jì)算得出溶液中枯草菌肽的質(zhì)量濃度，并計(jì)算出RSD值(表4)。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收率試驗(yàn)

稱取陰性飼料樣品作為本底樣品，分別添加0.20、0.50、1.00 mg/mL 三個(gè)不同質(zhì)量濃度的枯草菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.2～1.4的方法進(jìn)行試驗(yàn)，平行測(cè)定2次，計(jì)算出回收率，結(jié)果顯示回收率為93.0%～99.8%(表5)。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

枯草菌肽易溶于水，所以選擇蒸餾水作為提取溶劑。儀器條件的選擇參考了楊彩霞的方法[9]。

本試驗(yàn)從線性方程擬合、精密度、重現(xiàn)性和回收率等方面對(duì)方法的合理性進(jìn)行驗(yàn)證。將標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋，上機(jī)分析，以質(zhì)量濃度-峰面積擬合方程的相關(guān)系數(shù)為0.999 1。將陽性飼料樣品配制成一定質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰保留時(shí)間和峰面積的RSD值均較低。稱取陰性飼料樣品作為本底樣品，分別添加0.20、0.50、1.00 mg/mL 三個(gè)不同質(zhì)量濃度的枯草菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)結(jié)果顯示，三個(gè)不同質(zhì)量濃度溶液的回收率均較高。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，高效液相色譜方法適用于飼料中枯草菌肽含量的測(cè)定，該方法成本低、操作簡便、重現(xiàn)性好、精確度和靈敏度高。