UPLC/MS/MS法測定食用油中12種增香劑的含量*

林浩學(xué)

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001)

在大眾的平日生活中，中國人覺得食用油是不可或缺一種食材，幾乎每一餐都離不開它。食用油的質(zhì)量安全水平關(guān)乎普羅大眾的身體健康，某些不法食用油生產(chǎn)廠家往往為了取得更多的利潤，經(jīng)常在食用油的生產(chǎn)過程中添加非法香料以改變或提高油脂的香味，從而欺瞞消費(fèi)者。麥芽酚類、香蘭素類以及香豆素類常見的香味增效劑因其價(jià)格低廉，增味效果好，常被不法商家用來以次充好[1-9]。因此近年來國家有發(fā)布一些關(guān)于食品安全的政策，對香味增效劑的加添進(jìn)行了管控；在市場上在食用油中非法添加香味增效劑的事件也時(shí)有報(bào)道[10-14]。目前的科研實(shí)驗(yàn)中，并未有對食用油中幾種增香劑的同時(shí)測定，所以有必要建立一種高效、快速、準(zhǔn)確的香蘭素類、麥芽酚類、香豆素類添加劑檢測方法為食用油類食品安全質(zhì)量提供技術(shù)支持。由于食品添加劑的用量屬于微量范圍，本次實(shí)驗(yàn)可以采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油中香豆素、麥芽酚、香蘭素類添加劑的含量。目前國內(nèi)外的檢測實(shí)驗(yàn)中，使用的檢測方法有高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法等[15-22]，測定各類食品中的麥芽酚、香蘭素、香蘭素類非法添加劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多具有良好的線性關(guān)系和回收率。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent1290-AB5500型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Agilent公司- AB SCIEX公司；Auto EVA 60位全自動(dòng)平行濃縮儀，Reeko公司；DTC-27J超聲波清洗機(jī)，鼎泰(湖北)生化科技設(shè)備制造有限公司；Heraeus Multifug X3R高速冷凍離心機(jī)，塞默飛世爾科技(中國)有限公司；HandyStep ELECTRONIC全自動(dòng)電子移液器，塞默飛世爾科技(中國)有限公司；MS 3渦旋混合器，IKA公司。

1.2 試 劑

12種食品增香劑標(biāo)準(zhǔn)品：乙基麥芽酚(含量：99.70%)，上海ANPEL實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；香蘭素(含量：99.90%)，BE PURE公司；甲基香蘭素(含量：98.76%)，STANFORD CHEMICALS公司；乙基香蘭素(含量：98.81%)，STANFORD CHEMICALS公司；香豆素(含量：99.90%)，BE PURE公司；7-甲氧基香豆素(含量：97.70%)，F(xiàn)IRST STANDARD公司；二氫香豆素(含量：99.90%)，上海ANPEL實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；7-甲基香豆素(含量：99.40%)，LGC DR公司；7-乙氧基-4-甲基香豆素(含量：99.60%)，LGC DR公司；醋硝香豆素(含量：99.70%)，LGC DR公司；環(huán)香豆素(含量：100 μg/mL)，F(xiàn)IRST STANDARD公司；7-二乙胺香豆素(含量：99.00%)，PANPHY公司；12種增香劑標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)簡式見圖1。

圖1 12種增香劑標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)簡式

甲醇、乙腈、乙酸(色譜純)，山東禹王和天下新材料有限公司；正己烷、氯化鈉(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)材料

山茶油、大豆油、菜籽油、辣椒油、花椒油、橄欖油、花生油7種基質(zhì)樣品共50份。

2 試驗(yàn)方法

2.1 前處理方法

稱取1 g樣品(準(zhǔn)確至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，加入3 g氯化鈉，超聲10 min，4500 rpm離心后取上層清液2 mL于5 mL刻度管中，加入2 mL乙腈飽和正己烷進(jìn)行凈化處理，渦旋混合30 s，靜置分層后，棄置上層正己烷層，取下層乙腈清液過0.22 μm濾膜，待分析。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters BECH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 °C；進(jìn)樣量：2 μL；洗脫液組分為兩種溶液，A為0.3%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min, 10%B～90%B; 5～7.5 min, 90%B; 7.5～8 min，90%B～10%B; 8～10 min，10%B。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化正離子模式；霧化氣溫度：400 ℃; 霧化氣流速：3 L/min; 噴霧氣壓力：45 psi；毛細(xì)管電壓：5500 V；多反應(yīng)監(jiān)測掃描，采集參數(shù)見表1。

表1 12種化合物超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)

續(xù)表1

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的流動(dòng)相的選擇使用時(shí)，乙酸銨通常用來改善化合物的峰型，在正離子模式下，甲酸可以促進(jìn)目標(biāo)化合物電離。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸銨水(2 mM)溶液-乙腈和甲酸水(0.3%)溶液-乙腈兩種流動(dòng)相體系對12種化合物分離效果和響應(yīng)值進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)表明，兩種體系都能使12種化合物得到良好的分離，兩種體系中12種化合物的峰型沒有明顯的差別；但是從響應(yīng)值來看，在甲酸水(0.3%)溶液-乙腈流動(dòng)相體系中12種化合物的響應(yīng)要優(yōu)于乙酸銨水(2 mM)溶液-乙腈(見圖2，圖3)，尤其是香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素三種化合物的響應(yīng)值和信噪比要遠(yuǎn)優(yōu)于乙酸銨水(2 mM)溶液-乙腈體系，因此選擇甲酸水體系作為流動(dòng)相。

圖2 乙酸銨/水-乙腈體系下12種化合物的總流離子圖

圖3 甲酸/水-乙腈體系下12種化合物的總流離子圖

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以針泵注射的方式將0.2 μg/mL 12種化合物單標(biāo)分別注入質(zhì)譜儀中，以正離子模式進(jìn)行Q1掃描，得到母離子信息；并對其進(jìn)行MRM掃描，得到各個(gè)化合物的碎片離子信息；選取響應(yīng)值最高、干擾最小的離子作為定量離子，選取響應(yīng)值次高的離子作為輔助定性離子；進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)以及電噴霧電壓、霧化氣流量等參數(shù)。12種化合物的二級質(zhì)譜圖(見圖4所示)。

圖4 12種化合物的二級質(zhì)譜圖

3.3 提取溶劑的選擇

考慮到乙基麥芽酚及香蘭素類化合物都有酚羥基，香豆素類化合物都有香豆內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，且這幾種化合物都易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等極性有機(jī)溶劑，分別考察乙腈、甲醇提取效果。結(jié)果表明，這兩種有機(jī)溶劑對12種增香劑的提取回收率沒有顯著差異(見圖5所示)。但在雜質(zhì)去除方面，油脂類樣品中某些物質(zhì)(例如甾醇、磷脂等)更容易被甲醇溶解提取，難以進(jìn)行后續(xù)的樣品除雜凈化。因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同前處理方式對12種化合物回收率影響

3.4 凈化方式的選擇

比較了液液萃取-凈化與固相萃取-凈化的前處理方式，比較兩種方法的回收率差異。液液萃取-凈化實(shí)驗(yàn)的部分，使用乙腈飽和正己烷對提取液進(jìn)行凈化(具體步驟見2.3)；固相萃取-凈化選用HLB柱進(jìn)行凈化。結(jié)果表明，使用乙腈飽和正己烷凈化的提取回收率要優(yōu)于使用HLB固相萃取小柱凈化的提取回收率(圖5)。這可能是由于12種增香劑飽和蒸汽壓都較低，揮發(fā)性較強(qiáng)；而且在固相萃取使用HLB小柱凈化提取液時(shí)，存在兩次的氮吹步驟，在氮吹的過程中，目標(biāo)化合物被氮?dú)饬鲙ё?，逃逸至空氣中造成回收率下降。而液液萃取直接利用已?jīng)飽和正己烷凈化的過程中省取去了氮吹的步驟，可以很好地規(guī)避目標(biāo)化合物因氮吹導(dǎo)致的損失，因此采用乙腈飽和正己烷凈化。

3.5 分析方法的評價(jià)

3.5.1 方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍

表2 12種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

在設(shè)定的分析條件下，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按外標(biāo)法計(jì)算目標(biāo)化合物的含量。線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。由(見表2)可知，12種化合物在設(shè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5.2 方法的檢出限以及定量限

以3倍信噪比(S/N=3)作為方法的檢出限，以10倍信噪比(S/N=10)作為方法的定量限。結(jié)果表明，12種化合物的檢出限(limit of detection，LOD)在1.1～16.8 μg/kg之間；12種化合物的定量限(limit of quantification，LOQ)在3.6～55.4 μg/kg之間(見表3)，能夠充分滿足日常的檢測需求。

表3 方法的檢出限和定量限

3.5.3 方法的回收率以及精密度

分別選取6種不同基質(zhì)的空白樣品(菜籽油、辣椒油、芝麻油、花生油、花椒油、橄欖油)添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平6次，按照方法規(guī)定的步驟進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率范圍在72.3%～110.4%之間，RSD(n=6)為2.1%～6.9%，結(jié)果見表4。

表4 12種化合物的回收率和精密度

續(xù)表4

3.5.4 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)抽取監(jiān)督抽查的30批次6種基質(zhì)(菜籽油、辣椒油、芝麻油、花生油、花椒油、橄欖油)樣品，用本方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，其中乙基麥芽酚被檢出的樣品有4個(gè)，其含量范圍為19.2～5013 μg/kg，香蘭素被檢出的樣品有9個(gè)，其含量范圍為89.3～351 μg/kg，7-甲氧基香豆素被檢出的樣品有5個(gè)，其含量范圍為170～692 μg/kg，二氫香豆素被檢出的樣品多達(dá)10個(gè)，其含量范圍為1125～2698 μg/kg，其中以辣椒油、芝麻油、花椒油三種主要調(diào)味油的檢出率為最高，此現(xiàn)象應(yīng)引起有關(guān)市場監(jiān)督部門的重視。

4 結(jié) 論

本課題通過對樣品提取方式和前處理的優(yōu)化和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析儀器方法的優(yōu)化，建立了一種能夠同時(shí)檢測食用油中乙基麥芽酚、香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氫香豆素、7-甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、醋硝香豆素、環(huán)香豆素和7-二乙胺香豆素12種增香劑的分析方法。該方法前處理簡單，不需要復(fù)雜的操作，還能夠應(yīng)用于樣品量大的情況；在某些檢測物含量濃度較低的水平下也能有呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系和回收率，并且靈敏度和選擇性都很優(yōu)，檢出限和定量限都可以滿足日常食用油的檢測需求，能為我國食用油產(chǎn)品中的安全指標(biāo)檢測提供有力的技術(shù)支持。