超分子萃取技術(shù)測(cè)定滴眼液中的4種防腐劑*

粟 雯，陳志良，劉梯樓

(1 邵陽(yáng)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2 湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽(yáng) 422000)

對(duì)羥基苯甲酸酯又名尼泊金酯，因其抗菌性強(qiáng)，無臭無味，毒性低，刺激性小，被廣泛應(yīng)用于液體制劑中。目前使用較多的是對(duì)羥基苯甲酸甲酯(methylparaben，MP)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(ethylparaben，EP)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)和對(duì)羥基苯甲酸丁酯(butylparaben，BP)[1-2]。而滴眼液是眼科常用的液體治療制劑，通常需要加入微量的防腐劑，以提高藥物的穩(wěn)定性，并防止病原微生物的污染。但是滴眼液的不當(dāng)使用可能會(huì)損傷眼表, 進(jìn)而引發(fā)視功能的障礙, 而滴眼液中防腐劑的過量添加就是導(dǎo)致這些損害的重要原因[3-4]。

由于滴眼液中防腐劑含量較低，目前，前處理方法主要包括固相萃取[5-6]，液液萃取[7]，超聲萃取[8-9]等，但是這些方法一般所需溶劑用量高，分析時(shí)間長(zhǎng)，萃取效率較低，此外大量有機(jī)溶劑的使用也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和相關(guān)人員產(chǎn)生不利的影響。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單環(huán)保，綠色高效的前處理技術(shù)是很有必要的。超分子溶劑(supramolecular solvent，SUPRAS) 萃取技術(shù)一般是由兩種或兩種以上兩親性分子依靠非共價(jià)作用結(jié)合在一起，有組織的自發(fā)形成具有納米結(jié)構(gòu)的膠束聚集體。其由西班牙學(xué)者 Rubio等[10-11]提出，通常由長(zhǎng)鏈烷基醇或烷基酸與四氫呋喃(THF)和水混合，形成比水密度輕的反相膠束。由于其具有高濃度的兩親化合物，并且簡(jiǎn)單環(huán)保，萃取高效，被廣泛應(yīng)用于萃取不同極性的化合物[12]。

本研究以THF為分散劑，壬醇為萃取劑，在水中自發(fā)組裝形成超分子溶劑，對(duì)滴眼液進(jìn)行液液微萃取，結(jié)合高效液相色譜法，建立了滴眼液中4種對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)(MP、EP、PP、BP)的分析方法。本方法簡(jiǎn)單環(huán)保，快速高效，回收率高，可適用于羥苯酯類物質(zhì)的同時(shí)分析測(cè)定。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

E2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；H-1850臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀；QL-901渦旋混合器，海門其林貝儀爾儀器制造有限公司；BSA124S電子分析天平，德國(guó)賽多利斯。

甲醇，德國(guó)默克公司；四氫呋喃，Adamas；對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品(對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸乙酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，對(duì)羥基苯甲酸丁酯，Dr.E)；壬醇，Adamas；小樂敦復(fù)方?；撬岬窝垡海憷锥刂袊?guó)藥業(yè)有限公司：批號(hào)21K291；樂敦清復(fù)方氯化鈉滴眼液，曼秀雷敦中國(guó)藥業(yè)有限公司：批號(hào)21E051；珍視明四味珍層冰硼滴眼液，江西珍視明藥業(yè)有限公司：批號(hào)210209；屈臣氏蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

購(gòu)買的為溶于甲醇的1000 μg/mL的對(duì)羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別取4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將其混合均勻成100 μg/mL的混合物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用，使用時(shí)，用甲醇逐級(jí)稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的質(zhì)量溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 超分子溶劑的制備

取1 mL THF和300 μL壬醇迅速注入10 mL的離心管中，加入4.7 mL蒸餾水(保持溶劑總體積為6 mL)，渦旋30 s,混合均勻后以3000 r/min的速度離心5 min，用微量注射器移取上層有機(jī)相至玻璃瓶中，即得超分子溶劑，于4 ℃冰箱中密封保存。

1.4 樣品處理

移取滴眼液5 mL于離心管中，加入2 mL的超分子溶劑，渦旋振蕩3 min后，以3000 r/min的速度離心5 min，移取上層液體，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾后，待高效液相色譜測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱為Servo-PT C18120A(250 mm×4.6 mm×5 μm)；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為甲醇(A): 水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～2.0 min，5%～20% A；2.0～4.0 min，20%～50% A；4.0～7.0 min，50%～80% A；7.0～9.0 min，80% A；9.0～10.0 min，80%～5% A；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

分別對(duì)甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%甲酸水四種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，4種目標(biāo)物的分離度較好，沒有重合，且毒性相對(duì)較小，總的分析時(shí)間短，保留時(shí)間合適，在10 min內(nèi)可全部出峰。同時(shí)結(jié)果顯示，在波長(zhǎng)為254 nm處，四種目標(biāo)物都有較高的靈敏度，因此最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 超分子溶劑萃取條件的選擇

2.2.1 超分子溶劑的篩選

基于長(zhǎng)鏈烷基醇與有機(jī)溶劑(例如THF)和水自主裝形成的超分子溶劑，烷基醇的碳原子數(shù)種類不同，會(huì)導(dǎo)致反向膠束的孔徑不同，從而影響超分子溶劑的尺寸及萃取能力。本實(shí)驗(yàn)固定THF的含量為1 mL，選擇不同碳數(shù)的長(zhǎng)鏈烷基醇(C8～C12)與THF組成對(duì)應(yīng)的超分子溶劑，在相同條件下對(duì)苯甲酸酯類物質(zhì)進(jìn)行萃取。在萃取過程中，壬醇/THF/水超分子溶劑體系對(duì)四種對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)萃取率較高，且溶解性好操作方便，最終實(shí)驗(yàn)采用壬醇作為萃取溶劑，與THF和水組成超分子溶劑體系。

2.2.2 壬醇用量的優(yōu)化

本研究考察了壬醇用量分別為250、300、350、400和450 μL時(shí)目標(biāo)物質(zhì)的萃取率，如圖2所示。如圖所示，隨著壬醇用量的增加，各目標(biāo)物的萃取率先升高后降低，在壬醇的用量為300 μL時(shí)，四種目標(biāo)物都有較高的萃取率，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，壬醇的用量設(shè)置為300 μL。

2.2.3 THF用量的優(yōu)化

THF作為超分子溶劑的重要組成部分，其含量大小是影響萃取率的重要因素。如THF含量過低，那長(zhǎng)鏈烷醇會(huì)析出沉淀，無法形成超分子溶劑，如THF過高，其會(huì)分散在水溶液中，無法實(shí)現(xiàn)超分子溶劑體系的有效分層。本實(shí)驗(yàn)考察了THF的用量分別為0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL時(shí)目標(biāo)物質(zhì)的萃取率，如圖所示。隨著THF用量逐漸增大，四種目標(biāo)物的萃取率先升高后下降，當(dāng)THF的用量位于為1 mL時(shí)，四種目標(biāo)物的回收率位于86.2%～94.3%之間，且結(jié)果較為穩(wěn)定，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，THF的用量設(shè)置為1 mL。

2.2.4 超分子溶劑用量的優(yōu)化

本研究考察了不同超分子溶劑體積(0.5、1、1.5、2和 2.5 mL)對(duì)萃取效率的影響，隨著超分子溶劑體積的增加，對(duì)目標(biāo)物的萃取效率逐漸加強(qiáng)。當(dāng)超分子體積達(dá)到2 mL時(shí)，4種對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)都具有較高的萃取率，繼續(xù)加入超分子溶劑，萃取率基本維持穩(wěn)定，無較大變化。因此超分子溶劑最佳用量設(shè)置為2 mL。

圖1 (a)壬醇的用量、(b)THF的用量、(c)超分子溶劑體積對(duì)萃取率的影響

2.3 方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的色譜圖

依據(jù)1.5的色譜條件，4種對(duì)羥基苯甲酸酯類混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖2所示。

圖2 四種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖

2.3.2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

依據(jù)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法，分析一系列混合物標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，用各標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度(mg/L)和對(duì)應(yīng)的峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。并分別根據(jù)信噪比(S/N=3)和信噪比(S/N=10)計(jì)算方法檢出限和定量限，結(jié)果見表1所示。結(jié)果表明，4種對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)在0.1～50 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.9991，檢出限在4.8～5.9 μg/L，定量限在16.1～19.7 μg/L。

表1 對(duì)羥基苯甲酸酯類的線性范圍、線性方程、

2.3.3 回收率與精密度

表2 四種對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在最優(yōu)的萃取實(shí)驗(yàn)條件下，在待測(cè)樣品中分別添加低(20 μg/L)、中(50 μg/L)、高(100 μg/L)三個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定五組，如表2所示，樣品的平均回收率在92.8%～105.6%之間，RSD在1.3%～4.7%之間。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用，我們隨機(jī)對(duì)市場(chǎng)上銷售的三種滴眼液中的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)進(jìn)行了含量測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果表明，在這三種滴眼液中都未檢測(cè)到對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

本文建立了以壬醇-THF-水為超分子溶劑提取測(cè)定滴眼液中對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的新方法。分別對(duì)液相色譜條件，長(zhǎng)鏈烷基醇的選擇與用量、THF用量、萃取所用超分子溶劑進(jìn)行了優(yōu)化考察,并且通過HPLC實(shí)現(xiàn)了同步測(cè)定4類對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)。此種方法萃取步驟簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保，消耗體積少且回收率高,適用于滴眼液中羥苯酯類物質(zhì)的測(cè)定。