HPLC-DAD法同時(shí)測定防脫發(fā)類化妝品中6種抗雄激素藥物*

劉 丹，馬 瑩，楊 健,李澤夏瓊

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004)

頭發(fā)是人類形象的重要組成部分，脫發(fā)會(huì)影響患者的心理健康和生活質(zhì)量。研究表明，脫發(fā)人群普遍存在負(fù)性情緒、自我效能感及生活質(zhì)量下降的情況[1]。雄激素性脫發(fā)(AGA)是脫發(fā)中最常見的類型，在我國，AGA在男性中患病率約為21.3%，在女性中約為6.0%[2]?；谶@種情況，防脫發(fā)類化妝品在我國擁有相當(dāng)可觀的市場占有率。防脫發(fā)類化妝品在最新頒布的《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》中被列為6類特殊化妝品之一，風(fēng)險(xiǎn)程度較高。本文首次建立同時(shí)檢測防脫發(fā)類化妝品中氟他胺、非那雄胺、左炔諾孕酮、醋酸環(huán)丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺等6種抗雄激素藥物的HPLC-DAD方法，為防脫發(fā)類化妝品非法添加檢測提供一種新方法，在化妝品技術(shù)監(jiān)管工作中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

e2695型高效液相色譜儀，配2998型DAD檢測器，美國Waters公司；電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TALBOYS STD MINI型渦旋振蕩器，美國Henry Troemner公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TG16-Ⅱ型醫(yī)用離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 試 劑

1.2.1 對照品

氟他胺(批號：100598-201302；純度：99.8%)、非那雄胺(批號：100611-201503；純度：99.7%)、左炔諾孕酮(批號：100076-201205；純度：99.2%)、醋酸環(huán)丙孕酮(批號：100536-201602；純度：99.7%)、醋酸氯地孕酮(批號：100011-200702；純度：100%),中國食品藥品檢定研究院；度他雄胺(批號：AL200316-12；純度：99.25%),美國Stanford Chemicals公司。

1.2.2 試 劑

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲醇(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制一級水。

1.2.3 基質(zhì)樣品

膏霜基質(zhì)樣品為市售某品牌養(yǎng)發(fā)膏，乳液基質(zhì)樣品為市售某品牌洗發(fā)乳，水基質(zhì)樣品為市售某品牌育發(fā)液，經(jīng)檢測均不含上述6種藥物。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡ C18色譜柱(4.6 mm I.D. ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇:水=72:28；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：醋酸環(huán)丙孕酮、醋酸氯地孕酮為285 nm，其余4種物質(zhì)為225 nm；光譜掃描范圍：200～400 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下6種對照品各50 mg，分別置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1000 μg·mL-1的單對照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述6種儲(chǔ)備液各10 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg·mL-1的混合對照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對照品儲(chǔ)備液1 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得5 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

取膏霜、乳液樣品適量混勻，精密稱取0.5 g，置15 mL具蓋離心管中，加甲醇至10 mL，置渦旋振蕩器上渦旋至分散，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)20 min，6000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為樣品溶液。精密量取水溶液樣品0.5 mL，置15 mL具蓋離心管中，加甲醇至10 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在2.1條件下，6種物質(zhì)在25 min內(nèi)出峰，各色譜峰與相鄰色譜峰分離度均>1.5，理論塔板數(shù)以氟他胺峰計(jì)≥10000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3.2 檢出限和定量限考察

取膏霜、乳液基質(zhì)樣品各5 g，水基質(zhì)樣品5 mL，加甲醇100 mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液作為稀釋溶劑，將混合對照品溶液逐級稀釋，并取不同體積進(jìn)樣，記錄信噪比為3:1及10:1時(shí)的濃度及進(jìn)樣體積，計(jì)算檢出限和定量限，并按2.2.2條件計(jì)算檢出濃度和定量濃度。結(jié)果6種物質(zhì)的檢出限和定量限在三種基質(zhì)背景下均相同，具體見表1。

表1 檢出限和定量限

2.3.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取混合對照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為2、5、10、20、60、80、100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。分別自動(dòng)進(jìn)樣10 μL，以各組分的濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明6種物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)峰面積對濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 儀器精密度試驗(yàn)

分別取混合對照品溶液及混合對照品儲(chǔ)備液，作為低濃度和高濃度溶液進(jìn)行試驗(yàn)。分別按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各物質(zhì)峰面積的RSD，結(jié)果氟他胺、非那雄胺、左炔諾孕酮、醋酸環(huán)丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺低濃度溶液峰面積RSD依次為0.26%、0.67%、0.26%、0.17%、0.37%和0.39%，高濃度溶液峰面積RSD依次為0.14%、0.15%、0.18%、0.12%、0.12%和0.16%。結(jié)果表明低濃度和高濃度溶液測試時(shí)儀器精密度均良好。

2.3.5 重復(fù)性及回收率試驗(yàn)

取膏霜、乳液基質(zhì)樣品0.5 g，水基質(zhì)樣品0.5 mL，各12份，分為低濃度和高濃度兩組，每組6份；低濃度組每份精密加入混合對照品儲(chǔ)備液0.5 mL，高濃度組每份分別精密加入6種物質(zhì)的單對照品儲(chǔ)備液各1 mL，按2.2.2項(xiàng)下的方法分別制備低濃度、高濃度重復(fù)性及回收率供試溶液，同時(shí)取混合對照品溶液和混合對照品儲(chǔ)備液，作為低濃度、高濃度對照溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算各物質(zhì)的含量(μg)，并計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果平均加樣回收率為97.6%～99.8%，RSD為0.05%～0.97%。從RSD可見重復(fù)性良好，詳見表3。

表3 重復(fù)性及回收率結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取膏霜、乳液基質(zhì)樣品0.5 g，水基質(zhì)樣品0.5 mL，各2份，分為低濃度和高濃度兩組，按2.3.5項(xiàng)下的方法加樣處理，制得穩(wěn)定性溶液。分別于0、8、16、24、32、40、48小時(shí)進(jìn)行測定，計(jì)算各物質(zhì)峰面積的RSD，結(jié)果6種物質(zhì)在膏霜基質(zhì)中低濃度RSD為0.16%～1.31%，高濃度RSD為0.21%～0.79%；在乳液基質(zhì)中低濃度RSD為0.25%～0.73%，高濃度RSD為0.17%～0.45%；在水基質(zhì)中低濃度RSD為0.15%～0.80%，高濃度RSD為0.20%～0.55%。結(jié)果表明3種基質(zhì)條件下6種物質(zhì)的低濃度和高濃度溶液均在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 適用性試驗(yàn)

將2.1中的色譜柱替換為Waters XBridge C18柱和SHIMADZU Shim-pack VP-ODS柱，其它條件不變，按2.3.5項(xiàng)下的方法制備供試溶液，測定兩種色譜柱條件下的加樣回收率，結(jié)果在3種基質(zhì)中，XBridge柱所測得6種物質(zhì)平均加樣回收率低濃度為96.1%～99.6%，高濃度為94.8%～99.2%；Shim-pack柱所測得6種物質(zhì)平均加樣回收率低濃度為96.0%～99.7%，高濃度為96.7%～99.4%。3種色譜柱間回收率的RSD為0.11～1.69(n=36)。結(jié)果表明該方法對不同品牌色譜柱的適用性良好。

2.3.8 樣品測試

按2.1～2.2中的方法對市售18批防脫發(fā)類產(chǎn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出上述6種物質(zhì)；其中3批樣品中疑似檢出氟他胺峰，5批樣品中疑似檢出非那雄胺峰，但經(jīng)光譜確證為陰性。

3 討 論

3.1 檢測物及檢測方法的選擇

氟他胺為雄激素受體抑制劑，非那雄胺和度他雄胺均為5α-還原酶抑制劑，左炔諾孕酮、醋酸環(huán)丙孕酮和醋酸氯地孕酮為常見的孕激素，均具有較強(qiáng)的雄激素抑制作用，它們的防脫發(fā)作用在部分文獻(xiàn)中有所報(bào)道[3-7]。關(guān)于化妝品中上述6種物質(zhì)的檢測方法，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道多為LC-MS法同時(shí)檢測上述物質(zhì)中的2～3種[8-10]以及HPLC法檢測非那雄胺1種成分[11]，尚無HPLC法同時(shí)檢測化妝品中上述6種物質(zhì)的報(bào)道，本文為首次研究。HPLC是現(xiàn)階段化妝品中禁限用物質(zhì)檢測最為常規(guī)和廣泛使用的分析技術(shù)[12]，采用HPLC建立化妝品中非法添加物質(zhì)的檢測方法，更加有利于化妝品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本文考察了乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)的差異，結(jié)果兩者均能使6種物質(zhì)在25 min以內(nèi)完全分離，但乙腈在2.1色譜條件下出現(xiàn)倒峰，影響左炔諾孕酮出峰，且乙腈毒性略大，成本較高，故選擇甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

3.3 取樣量的考察

本文考察了膏霜、乳液樣品取樣量0.1 g、0.5 g、1.0 g時(shí)的情況，結(jié)果取樣1.0 g時(shí)，樣品在溶劑中較難分散，提取液較難過濾；取樣0.5 g時(shí)加樣回收率滿足要求，且較取樣0.1 g時(shí)檢出濃度更低，故選擇0.5 g為取樣量。

3.4 檢測波長的確定

經(jīng)DAD檢測器掃描，氟他胺、非那雄胺、左炔諾孕酮、醋酸環(huán)丙孕酮、醋酸氯地孕酮和度他雄胺的最大吸收波長依次為227.1 nm、204.7 nm、242.5 nm、284.0 nm、286.4 nm和203.5 nm選擇285 nm作為醋酸環(huán)丙孕酮和醋酸氯地孕酮的檢測波長、225 nm作為其余4種物質(zhì)的檢測波長，可以使各物質(zhì)的檢出限較為平均。6種物質(zhì)在200～400 nm間的光譜曲線均具有一定的特異性，在用于非法添加檢測的常量分析下可滿足定性確證的需求。

3.5 適用性說明

本文使用3種品牌的C18柱均能得到良好的分離度和回收率，但流動(dòng)相的比例需要進(jìn)行略微調(diào)整，以達(dá)到各物質(zhì)色譜峰之間良好的分離。建議選取碳載量較高的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本文建立了同時(shí)檢測防脫發(fā)類化妝品中非法添加6種抗雄激素類藥物的方法。通過單因素實(shí)驗(yàn)對色譜柱、流動(dòng)相、檢測波長、取樣量等因素進(jìn)行了考查，最終確定了適應(yīng)性較強(qiáng)的色譜條件，實(shí)現(xiàn)了良好的分離效果。對所建立的分析方法進(jìn)行的方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法靈敏度及準(zhǔn)確性較高，適用于化妝品中非法添加氟他胺等6種抗雄激素類藥物的定性、定量分析，為防脫發(fā)類化妝品監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支撐。