以多孔金電極為傳感界面的電化學(xué)雙標(biāo)記免疫傳感器研究*

畢燴元，沈燕婷，詹 顏，劉云龍，何 濤，李景晨，沈紅霞

(1 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2 嘉興市第二醫(yī)院，浙江 嘉興 314001)

腫瘤標(biāo)志物[1]的精確和早期診斷可以大大提高治療癌癥的成功率。當(dāng)前，腫瘤檢測多為針對單一腫瘤標(biāo)志物，而多腫瘤標(biāo)志物同時檢測可顯著提高診斷靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。因而開發(fā)高靈敏、簡便、快速的檢測方法對抗原或抗體的檢測具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值[2-3]。

電化學(xué)免疫傳感器已廣泛地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品工業(yè)等領(lǐng)域[4]。多孔納米金具有大的比表面積、良好的生物相容性，能負(fù)載更多抗體，可以有效地實現(xiàn)信號的放大，提高其檢測靈敏度和穩(wěn)定性。而且以不同的電活性物對抗體進行電化學(xué)標(biāo)記，可實現(xiàn)多種抗原的同時檢測[5-6]。

我們采用夾心法檢測抗原。探討硫堇和中性紅為電活性物質(zhì)，以多孔金電極為固相加載抗體。將硫堇和中性紅兩種電活性物質(zhì)分別標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔抗體，抗體抗原特異性結(jié)合，利用CV和DPV檢測兩者還原峰的大小。根據(jù)在不同電位的響應(yīng)信號的變化，間接地反映抗原抗體結(jié)合的信息，實現(xiàn)抗原的分析測定。

1 實驗內(nèi)容

1.1 實驗材料

化學(xué)藥劑：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-半胱氨酸、戊二醛、氯金酸、硫堇、硫酸、無水碳酸鈉等溶液均為優(yōu)級純或分析純;所有用水均為去離子水。

儀器設(shè)備：掃描電鏡,日本日立公司；電化學(xué)工作站,上海辰華儀器公司。

1.2 材料制備

在三頸瓶中加入195 mL二次水和4 mL 25 mM的氯金酸，開始加熱并攪拌，直至溶液沸騰，快速加入10 mM 檸檬酸鈉，溶液變色后，邊攪拌邊冷卻至室溫?？芍频昧椒秶?0～100 nm的AuNPs[7]。再分別制備羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體、不同濃度的正常兔抗原、不同濃度的正常鼠抗原等。

1.3 電化學(xué)標(biāo)記

硫堇的還原峰[8]在-0.2～0 V左右，中性紅的還原峰[9]在-0.5 V左右。TH以Au-S鍵為基礎(chǔ)，形成Au納米溶膠-電活性物質(zhì)-抗體復(fù)合物[10]。通過將NR的氨基與戊二醛的醛基相連，再與羊抗兔抗體上的氨基相連，從而形成NR標(biāo)記的NR-戊二醛-羊抗兔抗體。

1.4 多孔金電極的制備

在Na2CO3溶液中，以KAu(CN)2和KAg(CN)2為原料，采用電化學(xué)還原法在金電極表面沉積金銀合金膜，然后將電極浸泡在硝酸溶液中去合金化，較活潑的Ag被溶解，從而制備了高比表面積的多孔納米金電極。

1.5 制備電化學(xué)免疫傳感器

金電極用L-半胱氨酸修飾，再用戊二醛交聯(lián)L-半胱氨酸與抗體結(jié)合，用BSA封閉過夜，然后與抗原特異性結(jié)合，最后與Au納米溶膠-電活性物質(zhì)-抗體復(fù)合物上的抗體特異性結(jié)合，構(gòu)建成電化學(xué)免疫夾心傳感器。用三電極進行檢測，工作電極-免疫夾心金電極，參比電極-銀/氯化銀電極，對電極-鉑電極；用控制變量法，保證其他的量不變，只改變正常兔抗原和正常鼠抗原的濃度，依次測量不同抗原濃度下，電化學(xué)信號的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM表征

掃描電鏡(SEM)結(jié)果如圖1，圖2所示。

圖1 納米金溶膠的SEM圖像

圖2 多孔金電極表面的SEM圖像

由圖1可知制備得到的Au納米呈橢球狀，其形貌較均一，分散性好，有較大的比表面積，能夠維持生物分子的活性，表面帶負(fù)電可以靜電吸附較多的抗原或抗體，是制作免疫傳感器固載物的較優(yōu)選擇。

圖2清楚地看到制備所得的多孔金電極的表面，分布著大量納米級小孔，這使得金電極比表面積大大增加，提高了檢測靈敏度。

2.2 電活性標(biāo)記物的電化學(xué)性質(zhì)

電活性標(biāo)記物的氧化和還原峰的位置如圖3和圖4所示。

圖3 中性紅的循環(huán)伏安(CV)曲線

圖4 硫堇的循環(huán)伏安(CV)曲線

如圖3所示，表明中性紅的氧化峰電位在-0.55 V左右，還原峰電位在-0.5 V左右。

如圖4所示，表明硫堇的氧化峰電位在-0.2 V左右，還原峰電位在-0.1 V左右。

2.3 以多孔金電極為傳感介質(zhì)的電化學(xué)傳感器DPV表征

配置系列濃度的正常兔抗原和正常鼠抗原，構(gòu)成免疫夾心傳感器。用DPV測試不同正?？乖瓭舛鹊捻憫?yīng)電流ip。得到的組裝有NR和TH的雙標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器抗原濃度的電流響應(yīng)曲線，實現(xiàn)了兩種不同抗原的同時檢測，如圖5所示。

圖5 雙標(biāo)記電化學(xué)傳感器不同抗原濃度的電流響應(yīng)

如圖5所示，出現(xiàn)的二個峰分別是NR和TH的信號。表明可以同時測出所對應(yīng)的二種抗原濃度。進一步的實驗表明在相同抗原濃度時，多孔金電極時的信號比普通金電極高。證明了多孔金電極比表面積較大，從而檢測靈敏度更高。

2.4 以多孔金電極為傳感界面時抗原線性范圍和檢測限

如圖6所示，其中兩種抗原濃度分別為0.1、1、12.5、62.5、75、100、200 ng/mL。在1～100 ng范圍內(nèi)隨著抗原濃度增大，電流信號(ip)增強，表明在這個抗原濃度范圍內(nèi)，該免疫傳感器有較好的檢測效果。其中0.1 ng/mL和200 ng/mL時已明顯偏離線性。由此我們確定線性范圍為1～100 ng/mL。

圖6 兩種電化學(xué)活性標(biāo)記傳感器抗原濃度與電流線性關(guān)系圖

隨著抗原濃度增大，電化學(xué)信號增強，峰電流值變大，呈線性相關(guān)。

由圖6(a)可知，NR標(biāo)記的線性方程為y=0.0239x+3.4617，回歸決定系數(shù) R2=0.9447，按信噪比(S/N)=3，檢測限為0.1 ng/mL。

由圖6(b)可知，TH對應(yīng)的線性方程為y=0.0208x+3.1202，R2=0.9923，檢測限為0.1 ng/mL。

3 結(jié) 論

多孔納米金電極能實現(xiàn)高靈敏度的免疫分析。本實驗利用納米金免疫傳感器固載物，構(gòu)筑得到以NR和硫堇為電化學(xué)標(biāo)記物的三明治免疫夾心結(jié)構(gòu)傳感器。實驗表明多孔金“三明治結(jié)構(gòu)”傳感器能夠快速檢測抗原或抗體的存在，操作簡便高效，并且成本低，在醫(yī)學(xué)或其他檢測領(lǐng)域中具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。