太子參參須多糖對(duì)免疫抑制小鼠的保護(hù)作用

喬 石, 閔思明, 胡惠宇, 曾 麗, 杜鎣鎣, 周夢圓, 曾靖祺, 張炎達(dá), 馬玉芳

(1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建貝迪藥業(yè)有限公司，福建 寧德 355399)

環(huán)磷酰胺是使用最廣泛的抗腫瘤劑，可導(dǎo)致白細(xì)胞減少、骨髓抑制和免疫抑制[1].在藥理試驗(yàn)中，連續(xù)3 d以80 mg·kg-1CY腹腔注射小鼠，可構(gòu)建良好的免疫抑制小鼠模型[2]，表現(xiàn)為體重減輕、脫毛和精神不振等.CY能減少T細(xì)胞、B細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量[3]、淋巴細(xì)胞的自發(fā)增殖以及IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌[4].

太子參，又名孩兒參、童參等，臨床應(yīng)用悠久，具有良好的藥用價(jià)值和保健作用[5].太子參參須是太子參的不定根和根尖部分，占太子參總質(zhì)量的10%～15%[6]，在加工過程中常留塊根而棄參須，造成太子參資源的浪費(fèi).塊根和參須兩者均含有多糖和皂苷，參須多糖和皂苷含量分別為18.79%和0.25%，其中,參須多糖含量是塊根多糖含量的53.73%[7]，值得開發(fā)利用.太子參參須多糖(radix pseudostellariae fibrous roots polysaccharide, RPFRP)對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用[8]，其可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖及細(xì)胞因子分泌[9]以及修復(fù)免疫抑制小鼠的脾臟損傷[10]，但關(guān)于RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠保護(hù)作用的研究較少.本試驗(yàn)通過給小鼠灌服RPFRP兩周后腹腔注射環(huán)磷酰胺，檢測相關(guān)的免疫學(xué)指標(biāo)，探討RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠的保護(hù)作用，為太子參參須的利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 太子參參須多糖 太子參參須(Radixpseudostellariaefibrous roots)由福建貝迪藥業(yè)有限公司提供；RPFRP由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[8]，多糖含量為60%.

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選取體重為(18±2) g的清潔級(jí)雄性昆明小鼠[8]，檢驗(yàn)合格,編號(hào)為0005714，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.1.3 主要試劑 CY(CC30152825)購自Baxter Oncology GmbH公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(AC10238685)購自HyClone公司；胎牛血清(HQ202103)購自CellMax公司；APC Anti-Mouse CD3e(85-17-0031-81)、FITC Anti-Mouse CD4(FMF004-1000U)、PE Anti-Mouse CD8a(CB4286178)購自Tonbo Biosciences公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(S09FG211)、熒光定量PCR檢測試劑盒(21317600)購自Promega公司；淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1)(QC228)購自上海欽誠生物科技有限公司.

1.1.4 主要儀器 包括獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(IVC-Ⅱ型，蘇州市蘇杭科技器材有限公司產(chǎn)品)、X-22R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國，Beckman)、倒置顯微鏡(日本，Nikon)、CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo)、SW-CJ-2G雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品)、Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士，Tecan)、PCR儀(美國，BIO-RAD Thermal Cycler)和Real-time PCR儀(美國，BIO-RADCFX96TM Real-time System).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 96只清潔級(jí)KM雄性小鼠經(jīng)1周適應(yīng)性飼喂后， 隨機(jī)平均分成CK組(空白組)，CY組(模型組)，RPFRP低、中、高劑量(50、100、200 mg·kg-1)組和APS組(陽性組).第1～14天，CK組和CY組小鼠分別灌胃雙蒸水，RPFRP組和APS組分別灌胃相應(yīng)劑量的RPFRP和APS，第15～17天，CK組腹腔注射生理鹽水，其余各組分別腹腔注射80 mg·kg-1的CY.各組小鼠采食、自由飲水.

1.2.2 小鼠血清細(xì)胞因子的檢測 末次給藥24 h后，小鼠摘眼球采血，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清，置-20 ℃保存.ELISA法檢測血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量[11]，具體操作方法見試劑盒說明書.

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 采用斷頸脫臼法迫殺小鼠，75%乙醇浸潤，無菌取脾，滅菌研缽中研碎脾臟，加入PBS后混勻，過濾得脾細(xì)胞懸液，離心留沉淀；加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，離心，PBS洗滌3次，再以1 500 r·min-1離心5 min；加入2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液，渦旋混勻，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞應(yīng)大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)·mL-1，備用[12].

1.2.4 小鼠脾臟NK細(xì)胞活性的測定 96孔板中加入100 μL脾細(xì)胞懸液(1.5×107個(gè)·mL-1)作為效應(yīng)細(xì)胞，另取等量指數(shù)生長期的YAC-1靶細(xì)胞(3×105個(gè)·mL-1)作為試驗(yàn)孔(效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的體積比為50∶1)，另做效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔(50 μL效應(yīng)細(xì)胞懸液+50 μL完全培養(yǎng)液)、靶細(xì)胞對(duì)照孔(50 μL靶細(xì)胞懸液+50 μL完全培養(yǎng)液)和空白對(duì)照孔(100 μL完全培養(yǎng)液)[10].于37 ℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)4 h.隨后向各孔加入50 μL MTT液(2 mg·mL-1)，再置37 ℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)4 h；取出該板，離心，棄上清，按每孔150 μL加入DMSO溶液，于細(xì)胞板振蕩器上避光充分振蕩，以酶標(biāo)儀492 nm處測定各孔D值，計(jì)算各組NK細(xì)胞殺傷活性.計(jì)算公式如下：

NK細(xì)胞殺傷率/%={D(靶細(xì)胞對(duì)照組)-[D(試驗(yàn)組)-D(效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組)]/D(靶細(xì)胞對(duì)照組)}×100

1.2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的檢測 采用MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖.96孔板(除空白孔)中加入100 μL脾細(xì)胞懸液(1.5×106個(gè)·mL-1)，空白孔中加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)液，RPFRP協(xié)同ConA或LPS的試驗(yàn)孔分別加100 μL ConA或LPS(ConA, LPS終質(zhì)量濃度分別為4、10 μg·mL-1)[13].于37 ℃、50 mL·L-1CO2條件下培養(yǎng)44 h，隨后各孔加入50 μL MTT液(2 mg·mL-1)，再置37 ℃、50 mL·L-1CO2條件下培養(yǎng)4 h；取出96孔板，離心，棄上清，各孔加入150 μL DMSO，于細(xì)胞板振蕩器上避光振蕩混勻，采用酶標(biāo)儀測定各孔D492 nm值 .用刺激指數(shù)(SI)表示淋巴細(xì)胞的增殖能力，SI=D492 nm(試驗(yàn)孔)/D492 nm(空白孔).

1.2.6 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 取適量脾細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約106個(gè))，分別加入稀釋后的CD3+、CD4+和CD8+[4]單抗10 μL(0.05 g·L-1)，混勻，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，15 min后，離心[10]棄上清；洗滌離心后用300 μL中性PBS重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測.同時(shí)設(shè)CD3+、CD4+和CD8+單獨(dú)染色標(biāo)記管各1支、空白對(duì)照管1支.

1.2.7 小鼠脾細(xì)胞凋亡的檢測 取脾細(xì)胞懸液，離心留下層沉淀，用PBS洗滌2次，再離心，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞.分別加入500 μL的Binding Buffer液懸浮細(xì)胞、5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide，室溫避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠脾細(xì)胞的凋亡[14].

1.2.8 小鼠脾細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 取脾細(xì)胞懸液，經(jīng)TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，利用qRT-PCR檢測各組小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、T-bet、GATA-3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.各引物見表1，以β-actin為內(nèi)參基因[14].計(jì)算公式為：

相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ctβ-actin)對(duì)照組

Ct= -1/lg(1+Ex)·lgX0+lgN/lg(1+Ex)

式中，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

從表2可知:與CY組相比，RPFRP各組和APS組IL-4含量顯著升高(P<0.05)；RPFRP高劑量組IL-6含量顯著升高(P<0.05)；RPFRP中、高劑量組和APS組IFN-γ含量顯著升高(P<0.05).

表2 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影響1)

2.2 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠NK細(xì)胞活性的影響

從表3可知:與CK組比較，各組NK細(xì)胞殺傷活性均顯著降低(P<0.05)；CY組NK細(xì)胞殺傷活性最低，且RPFRP中劑量組和APS組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于CY組(P<0.05).

表3 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響1)

2.3 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

從表4可知:較CK組，各組小鼠T、B細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；但與CY組相比，RPFRP中、高劑量組和APS組小鼠T細(xì)胞的刺激指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，RPFRP低、中劑量組和APS組小鼠B細(xì)胞的刺激指數(shù)顯著升高(P<0.05).

表4 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響1)

2.4 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群的影響

從表5可知，與CK組相比，CY組脾臟中CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05).較CY組，RPFRP各組CD3+比例均顯著提高(P<0.05)，RPFRP低、高劑量組和APS組的CD3+、CD4+和CD8+比例均顯著提高(P<0.05)，RPFRP中、高劑量組和APS組的CD4+/CD8+比值顯著升高(P<0.05).

表5 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠脾CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例的影響1)

2.5 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響

如圖1所示:各組早期凋亡率和總凋亡率以及CY組晚期凋亡率較CK組均顯著升高(P<0.05)；與CY組相比，RPFRP各組和APS組早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著下降(P<0.05).

FITC+/PI-：早期凋亡率.FITC-/PI+:晚期凋亡率.TOTAL:總凋亡率.不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.6 RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖2所示，與CK組相比，CY組、RPFRP各組及APS組IL-2 mRNA、IL-4 mRNA和T-bet的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)，CY組和RPFRP低劑量組的IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，CY組與RPFRP低劑量組IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)；CY組、RPFRP低、高劑量組GATA-3的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，CY組和RPFRP各組T-bet/GATA-3比值顯著降低(P<0.05).與CY組相比，RPFRP低劑量組IL-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，RPFRP中、高劑量組和APS組IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.05)，RPFRP中、高劑量組和APS組IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，RPFRP低、中劑量組和APS組T-bet的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，RPFRP各組和APS組T-bet/GATA-3比值顯著升高(P<0.05).

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起重要作用，具有多種類型.目前已知CD4+T細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為兩種效應(yīng)表型：T輔助細(xì)胞1型(Th1)和T輔助細(xì)胞2型(Th2)，前者驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答朝向細(xì)胞免疫，而后者促進(jìn)體液或過敏反應(yīng)[15].Th細(xì)胞亞群的功能取決于產(chǎn)生的細(xì)胞因子的特定類型，如Th1細(xì)胞的GM-CSF(粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、IL-2、IFN-γ和TNF-α，Th2細(xì)胞的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10[16].本研究發(fā)現(xiàn)：較CY組，RPFRP中、高劑量組和APS組的IFN-γ含量顯著升高，RPFRP各組和APS組的IL-4含量顯著升高，RPFRP高劑量組的IL-6含量顯著升高.表明RPFRP對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的分泌有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)其機(jī)體的免疫反應(yīng).

NK細(xì)胞活性測定是分析機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要手段之一[17]，常用于衡量細(xì)胞非特異性免疫的狀況.其活性會(huì)因表面表達(dá)的各種抑制性分子而減弱，研究發(fā)現(xiàn)其不僅與抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生自身免疫疾病時(shí)也能參與其中[18].研究表明，白扁豆多糖中、高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞的活性[19].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠注射CY后NK細(xì)胞活性顯著降低，但RPFRP能有效拮抗其降低作用，表現(xiàn)出對(duì)NK細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用，與以上研究結(jié)果一致.

脾淋巴細(xì)胞(T/B淋巴細(xì)胞)的增殖是對(duì)抗原或有絲分裂原誘導(dǎo)的刺激的反應(yīng)，是一種典型的非特異性免疫應(yīng)答[20].T淋巴細(xì)胞及其分泌的淋巴因子與適應(yīng)性或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)；B淋巴細(xì)胞和分泌抗體的漿細(xì)胞是參與體液免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素.通常，T淋巴細(xì)胞免疫是通過ConA刺激的細(xì)胞增殖來檢測的，而B淋巴細(xì)胞免疫是通過LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖來檢測.本試驗(yàn)結(jié)果顯示：CY組小鼠T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均降低，即CY可抑制脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化.RPFRP可使小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)較CY組顯著升高(P<0.05)，說明RPFRP可以改善CY對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用.

目前研究證明，T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例是評(píng)估內(nèi)部免疫平衡最有價(jià)值的參數(shù)，細(xì)胞免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)指標(biāo)有CD3+、CD4+、CD8+含量和CD4+/CD8+比例，CD4+/CD8+比例升高表明免疫反應(yīng)的上調(diào)，反之則表明免疫反應(yīng)降低[21].Huang et al[22]研究表明，中、高劑量荔枝果肉多糖可提高由CY導(dǎo)致免疫損傷小鼠CD4+/CD8+的比值.研究表明[23]，通過CY造成小鼠的免疫抑制模型，其CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比例明顯低于正常小鼠.而本試驗(yàn)結(jié)果顯示：CY組顯著下調(diào)了CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+比例，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫功能失調(diào)，RPFRP對(duì)上述指標(biāo)均有顯著的上調(diào)作用，在一定程度上能夠糾正這種失衡，也進(jìn)一步表明RPFRP對(duì)CY引起的免疫抑制狀態(tài)有明顯的保護(hù)作用.

淋巴細(xì)胞的凋亡涉及到機(jī)體免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，如凋亡數(shù)目過多則會(huì)引起免疫功能障礙[24].刺五加多糖可抑制因CY所致小鼠脾淋巴細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率的升高[25].本研究結(jié)果同樣顯示，RPFRP能顯著抑制小鼠腹腔注射CY后細(xì)胞各期凋亡率的升高，從而起到對(duì)免疫抑制小鼠的保護(hù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)論[24-25].

T-bet和GATA-3可以調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化為Th1和Th2細(xì)胞，在維持Th1和Th2型免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[26].Chakir et al[27]研究表明，Th1/Th2的變化可通過T-bet/GATA-3的變化來表示.研究[28]表明，Th1、Th2型細(xì)胞的變化可通過檢測IFN-γ和IL-4的含量來間接得知.本研究結(jié)果顯示，CY可顯著降低小鼠IL-2 mRNA、IL-4 mRNA和T-bet的轉(zhuǎn)錄水平，而一定濃度的RPFRP可顯著提高免疫抑制小鼠IL-2 mRNA、IFN-γ mRNA和T-bet mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以及T-bet/GATA-3比值，表明RPFRP可以通過調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子mRNA和轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄因子的分泌，從而促使免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫水平趨于正常狀態(tài).

本文研究結(jié)果表明，RPFRP通過調(diào)節(jié)小鼠血清細(xì)胞因子的分泌，提高NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量，減少脾淋巴細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)小鼠脾細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，從而發(fā)揮其對(duì)免疫抑制小鼠的保護(hù)作用.太子參參須多糖有望在動(dòng)物應(yīng)激和免疫佐劑等方面發(fā)揮一定的作用.