微波凍融法預處理用于酵母菌落PCR檢測

李 闖, 彭志清, 李寅琛, 吳升山,2,3, 林 鹿,2,3, 曾憲海,2,3

(1.廈門大學能源學院，福建 廈門 361102；2.福建省生物質(zhì)清潔高值化技術工程研究中心，福建 廈門 361102；3.廈門市生物質(zhì)清潔高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361102)

釀酒酵母是一種典型的模式微生物，在生命科學研究中發(fā)揮著重要作用.因具備生長迅速、基因操作簡單、同源重組能力強等特點[1-2]，釀酒酵母成為真核基因表達中最常見的宿主系統(tǒng).隨著基因編輯技術的高速發(fā)展，釀酒酵母在大規(guī)模DNA片段組裝等合成生物學領域已有廣泛的應用[3-4].

在酵母底盤中進行基因操作，為確保其準確性，需對DNA片段引入或刪除進行鑒定，常規(guī)步驟包括單菌落擴大培養(yǎng)、收集并裂解細胞、提取高純度DNA模板及PCR檢測[5]，在進行大規(guī)模篩選工作時，該方法往往成本高且效率低；相反，菌落PCR檢測方式無需預先分離或純化DNA，而是以菌體為模板來完成靶標序列的擴增[6]，可以有效避免上述弊端.然而與傳統(tǒng)原核微生物不同，釀酒酵母細胞壁由復雜多糖和少量蛋白質(zhì)組成，具有較強韌性.特殊的細胞壁結(jié)構使其難以被簡單的高溫程序破壞，因此將釀酒酵母直接作為模板進行PCR檢測的成功率較低[7]，需使用預處理方式破壞細胞壁，再進行菌落PCR以增強檢測效率.目前已有文獻報道了釀酒酵母的多種預處理方式，如通過消解酶水解細胞壁，使用氫氧化鈉、醋酸鋰、十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100處理酵母，均有效提高了檢出率[8-12]，但酶制劑成本較高，酶解緩沖液以及化學試劑中金屬離子的引入會干擾PCR檢測的穩(wěn)定性[13]，極大制約了菌落PCR在釀酒酵母中的應用.

本研究通過對比不同預處理方法，探索出一種高效酵母菌落PCR檢測方法.該方法無需輔助物質(zhì)的添加，使用微波結(jié)合凍融的方式處理酵母菌液，以其為模板進行PCR檢測，成本低、效率高、穩(wěn)定性好，不僅適用于不同基因操作模式下陽性克隆的篩選，還可用于3 000 bp以上長鏈DNA片段的檢測；此外，該方法可應用于樹干畢赤酵母和巴斯德畢赤酵母陽性克隆的篩選.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌DH5α、野生型二倍體釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YD202、單倍體釀酒酵母BY4741、巴斯德畢赤酵母(Komagataellaphaffii)GS115均由廈門大學生物質(zhì)燃料與化學品團隊保藏；樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)CGMCC 2.3250購自中國普通微生物菌種保藏管理中心.

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母抽提物、10 g·L-1氯化鈉；Yeast Extract Peptone Dextrose(YEPD/YPD)培養(yǎng)基：20 g·L-1胰蛋白胨、10 g·L-1酵母抽提物、20 g·L-1葡萄糖.

分別向以上體系中添加終濃度為20 g·L-1的瓊脂，配制成相應的固體培養(yǎng)基.在制備抗性平板時，向滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μg·mL-1的氨芐青霉素，向YPD固體培養(yǎng)基中加入終濃度為200 μg·mL-1的潮霉素B或G418.

1.1.3 質(zhì)粒與DNA片段 釀酒酵母木糖異構酶(XI)表達質(zhì)粒pRS41H-xylA、表面展示型XI表達質(zhì)粒pRS41H-xylA-sag1，巴斯德畢赤酵母特異蛋白表達質(zhì)粒pPIC9K-catcher、pPIC9K-xynA均由無縫克隆技術構建.釀酒酵母非特異性醛糖還原酶敲除盒gre3_U-hpt-gre3_D、δ位點整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2，樹干畢赤酵母己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D均通過重疊延伸PCR方式構建.其中，hpt為潮霉素B抗性基因，而樹干畢赤酵母屬于CUG分支酵母，將常規(guī)亮氨酸密碼子CUG翻譯為絲氨酸[14]，故選用經(jīng)過突變后的潮霉素B抗性基因hpt_m作為篩選標記[15].

1.1.4 引物 根據(jù)待測片段的特性共設計7組引物，均由上海生工生物工程公司合成，引物序列詳見表1.

表1 菌落PCR檢測所使用的引物

1.1.5 主要試劑與設備 2×RapidTaqMaster Mix、2×Phanta Flash Master Mix、DL5000 DNA Marker、One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊公司；抗生素G418、潮霉素B購自上海生工生物工程公司；PEG3350購自上海新鉑化學技術公司；LiAc購自上海麥克林生化科技公司.其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純.

基因擴增儀、電泳儀、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司；微型高速離心機購自德國Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司；700 W微波爐購自廣東美的公司.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒及DNA片段的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母醋酸鋰/聚乙二醇轉(zhuǎn)化參照Gietz[16]的方法進行，并適當優(yōu)化.完成感受態(tài)酵母細胞的制備和轉(zhuǎn)化體系的配制后，于30 ℃溫浴30 min，42 ℃熱激25 min，在500 μL YPD培養(yǎng)基中復蘇2 h，吸取100 μL培養(yǎng)液涂布選擇性平板，培養(yǎng)2～3 d后，挑選單菌落檢測陽性克隆.

畢赤酵母使用電轉(zhuǎn)化法進行DNA的轉(zhuǎn)化[17].轉(zhuǎn)化時使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯，電穿孔系統(tǒng)設置電壓2 000 V、電容25 μF、電阻200 Ω，轉(zhuǎn)化完成后在選擇性平板上涂布相應菌液.

1.2.2 酵母質(zhì)粒及基因組DNA的獲取 在抗性平板上挑選單菌落，接種至20 mL YPD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期(D600 nm=8～10)時，收集菌體.分別使用北京天根生化公司的酵母質(zhì)粒提取試劑盒和基因組DNA提取試劑盒進行酵母質(zhì)粒及基因組DNA的提取.

1.2.3 預處理酵母制備PCR模板的方法 直接法：使用無菌牙簽從篩選平板上挑取少量菌體直接用于PCR檢測.

水浴法：挑取單菌落接種至20 mL抗性YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)(D600 nm=4～5)，取1.5 mL菌液，于12 000 r·min-1離心15 s，棄上清，用200 μL ddH2O重懸菌體，于12 000 r·min-1再次離心15 s，棄上清，用200 μL TE緩沖液重懸菌體，沸水浴10 min，于12 000 r·min-1離心5 min，取1 μL上清作為PCR模板.

水浴凍融法：使用與水浴法同樣的方式收集菌體，沸水浴10 min，于-80 ℃冷凍處理10 min，完成后再次沸水浴10 min，于12 000 r·min-1離心5 min，取1 μL上清作為PCR模板.

微波法[18]：使用無菌牙簽挑取菌體至PCR管壁，用700 W微波爐全功率處理5 min，于-20 ℃快速冷卻至室溫后作為PCR模板.

微波凍融法：取單菌落接種至含2 mL抗性YPD培養(yǎng)基的5 mL無菌離心管中，過夜培養(yǎng)(D600 nm=1.5～2.0)，取10 μL菌液至PCR管中，用700 W微波爐全功率處理5 min，于-80 ℃冷凍10 min，快速解凍，再次用微波爐全功率處理2 min，取1 μL菌液作為PCR模板.

1.2.4 PCR檢測 按照試劑使用說明配制20 μL反應體系進行PCR檢測.以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預處理方式下酵母形貌的比較

為了比較不同預處理方式對酵母形貌的影響，以野生型釀酒酵母為研究對象，按照“1.2.3”中的方法處理菌體.顯微鏡下觀察的結(jié)果(圖1)顯示：未經(jīng)處理的酵母輪廓清晰，并展現(xiàn)出芽特性；水浴法處理后，部分酵母細胞體積膨脹，有少數(shù)胞體破裂；酵母經(jīng)過水浴凍融和微波凍融處理后的效果相似，部分細胞內(nèi)容物溢出且細胞質(zhì)壁分離明顯；與水浴法、水浴凍融法、微波凍融法不同，微波法處理后酵母整體呈降解趨勢，大量細胞以碎片形式存在.表明以上4種處理方式均可在不同程度上破壞酵母細胞，與其他3種方法相比微波法的破胞效率最高.

a：原始酵母細胞；b：水浴處理；c：水浴凍融處理；d：微波處理；e：微波凍融處理.

2.2 不同預處理方式對酵母菌落PCR檢測的影響

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將木糖異構酶游離表達質(zhì)粒pRS41H-xylA轉(zhuǎn)化至野生型釀酒酵母中，使用潮霉素B抗性平板進行克隆子的篩選，結(jié)果見圖2a.隨機挑選5個單菌落經(jīng)過5種預處理方式制備模板進行菌落PCR檢測，其瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖3所示.當以試劑盒提取質(zhì)粒為PCR模板時(圖3a)，電泳條帶與XI開放閱讀框長度1 320 bp保持一致，表明重組質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)化.然而，直接以菌體為模板(圖3b)或采用水浴法(圖3c)和微波法(圖3e)制備模板，電泳圖譜顯示無條帶或微弱目標條帶，難以實現(xiàn)檢測目的.采用水浴凍融法(圖3d)和微波凍融法(圖3f)處理菌體后進行PCR檢測，電泳圖譜均顯示出與質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果相吻合的目標條帶，但微波凍融法表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性.

a：釀酒酵母pRS41H-xylA；b：釀酒酵母Δgre3∷hpt.

a：質(zhì)粒模板；b：直接模板；c：水浴模板；d：水浴凍融模板；e：微波模板；f：微波凍融模板(M：DL5000 Marker；1～5：單菌落).

向釀酒酵母中導入DNA片段gre3_U-hpt-gre3_D后，通過同源重組的方式敲除非特異性醛糖還原酶基因gre3，抗性篩選結(jié)果見圖2b.挑選5個單菌落，使用不同預處理方式制備的模板進行PCR檢測，結(jié)果如圖4所示.以提取的基因組DNA為模板時(圖4a)，電泳圖譜顯示于2 100 bp處存在明顯條帶，其中，泳道3、4更為明亮.測序結(jié)果顯示，以上兩條DNA片段即為擴增所得的gre3基因敲除盒.采用直接法(圖4b)和微波法(圖4e)制備的模板均無法完全擴增出目標條帶，檢測結(jié)果顯示假陰性率高.相比水浴法和水浴凍融法，采用微波凍融法(圖4f)制備的模板進行菌落PCR檢測的穩(wěn)定性更好.此外，菌落PCR仍能檢測出800 bp左右的待敲除片段，表明在多個單菌落中，基因敲除盒部分整合至二倍體酵母染色體中，敲除基因同源位點仍存在完整的gre3基因.

a：基因組模板；b：直接模板；c：水浴模板；d：水浴凍融模板；e：微波模板；f：微波凍融模板(M：DL5000 Marker；1～5：單菌落).

對于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和染色體整合兩種體系，直接以酵母菌體為模板進行PCR檢測，無法擴增出目的片段，表明通過PCR無法使酵母細胞壁結(jié)構遭受破壞而暴露核酸物質(zhì).水浴法所得的電泳條帶較暗，在經(jīng)過冷凍和2次水浴后，菌落PCR靈敏度提升明顯，但穩(wěn)定性不足，可能由長時間高溫破壞核酸結(jié)構所致.由圖1d可知，微波法處理后的酵母破胞明顯，大量內(nèi)容物溢出以及劇烈變化的物理環(huán)境導致DNA降解等因素均可導致PCR檢測結(jié)果呈假陰性.相比其他預處理方法，微波凍融法操作簡單，所得電泳圖譜條帶清晰，耗費較少時間即可達到常規(guī)試劑盒提取法相同的檢測效果.

2.3 酵母長鏈DNA片段的檢測結(jié)果

使用醋酸鋰/聚乙二醇轉(zhuǎn)化法分別向野生型釀酒酵母和BY4741中導入δ位點整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2和表面展示型XI表達質(zhì)粒pRS41H-xylA-sag1，分別使用G418和潮霉素B平板進行篩選.在選擇性平板上隨機挑選單菌落，使用微波凍融法制備的模板進行PCR檢測.電泳圖譜(圖5)顯示，基因組模板和微波凍融模板在4 000 bp左右處有明顯條帶，與插入δ位點的特征序列長度相同.圖6b顯示，泳道1、2、3、4、6在3 000～5 000 bp處有單一條帶，與質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果(圖6a)一致.以上兩種檢測結(jié)果表明，使用微波凍融法制備的模板進行菌落PCR可用于釀酒酵母長鏈DNA片段的檢測.

a：基因組模板；b：微波凍融模板(M：DL5000 Marker；1～5：單菌落).

a：質(zhì)粒模板；b：微波凍融模板(M：DL5000 Marker；1～6：單菌落).

2.4 畢赤酵母菌落PCR檢測結(jié)果

使用電轉(zhuǎn)化法向樹干畢赤酵母中導入己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D，在獲取轉(zhuǎn)化子后采用微波凍融法制備模板，使用nag5上下游引物對基因敲除情況進行PCR檢測.結(jié)果(圖7)顯示，以樹干畢赤酵母原始基因組DNA作為對照可以擴增出2 233 bp的待敲除片段，而對于樹干畢赤酵母nag5敲除體系，大部分篩選所得的單菌落可擴增出3 456 bp的nag5基因敲除盒.

C：原始基因組模板；M：DL5000 Marker；1～8：微波凍融模板.

使用電轉(zhuǎn)化法向巴斯德畢赤酵母中分別導入使用限制酶SalⅠ線性化處理后的質(zhì)粒pPIC9K-xynA、pPIC9K-catcher，在篩選平板上獲取單菌落后，采用微波凍融法制備PCR模板，使用AOX1通用引物擴增目標條帶.結(jié)果(圖8)顯示：兩種體系均可擴增得到2 200 bp的野生型AOX1基因，表明獲得的單菌落均為甲醇利用野生型(Mut+)；同時，泳道1～4、5～10分別在1 200和1 700 bp處有明顯條帶，與組合AOX1基因上下游同源序列的目的基因長度相匹配.表明微波凍融模板不僅適用于釀酒酵母菌落的PCR檢測，在畢赤酵母中亦有較好的檢測效果.

a：pPIC9K-xynA；b：pPIC9K-catcher(M：DL5000 Marker；1～4、5～10：微波凍融模板).

3 討論

使用菌落PCR篩選大腸桿菌陽性克隆時，在PCR預變性步驟持續(xù)高溫的作用下，菌體會部分裂解而暴露DNA，可直接作為菌落PCR檢測的模板.與之不同的是，酵母菌落PCR檢測成功的關鍵是通過預處理方式破壞細胞壁結(jié)構，以提高聚合酶與擴增模板的接觸概率，來實現(xiàn)PCR的順利進行.酵母預處理方法包括酶法、化學法、物理法.酶法借助消解酶、蝸牛酶等酶制劑的水解作用來處理酵母細胞壁，消除PCR檢測的屏障，但成本較高、作用時間長，且對細胞壁組分復雜的野生型酵母的作用并不顯著，一般用于輔助其他處理方式，以協(xié)同方式完成破胞[19].化學法需添加醋酸鋰、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100改變細胞壁的通透性，以提高菌落PCR檢測的成功率，但化學試劑的引入會干擾PCR體系，對聚合酶活性產(chǎn)生較大的影響[13].物理法常使用高溫、冷凍、微波、研磨等方式破壞細胞結(jié)構以達到釋放DNA的目的[20]，該方法操作簡單，但部分處理方式的PCR檢測效果并不理想.基于物理法的優(yōu)勢，本研究對不同處理方式與菌落PCR檢測結(jié)果之間的關系進行了探究.

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)可直接使用酵母菌體為模板進行菌落PCR檢測用于分子遺傳鑒定，對1 500 bp以內(nèi)的短鏈基因片段有較好的檢測效果[7]；但本研究采用直接法制備的野生型釀酒酵母模板進行菌落PCR檢測，無法檢測出目標條帶.試驗結(jié)果不一致推測是由于酵母的遺傳背景差異較大且野生型釀酒酵母細胞壁結(jié)構復雜[21].相比水浴法，采用水浴凍融法制備的模板進行菌落PCR檢測時，其檢測靈敏度提升明顯，與通過冰晶破壞細胞壁可以提高檢測成功率的快速凍融法[22]一致，然而長時間的高溫環(huán)境以及反復凍融操作均會破壞基因組DNA結(jié)構，影響后續(xù)PCR檢測結(jié)果.據(jù)報道，微波法制備的模板適用于釀酒酵母2 000 bp以內(nèi)DNA片段的快速檢測[18]，但在操作中發(fā)現(xiàn)此法的PCR模板量難以得到精確控制，最優(yōu)微波處理時間亦隨菌體量和酵母遺傳背景的不同而改變；同時，菌體以及微波處理時間過長導致細胞內(nèi)容物溢出(圖1d)均可成為PCR檢測的干擾因素.因此，本研究使用微波法制備的模板進行菌落PCR檢測的靈敏度低、穩(wěn)定性較差(圖3e、4e).與微波法不同，微波凍融法以酵母菌液為操作對象，使用長時間微波處理可以保證微波破胞的同時降低高溫對酵母基因組的破壞，保持基因組的完整性，在經(jīng)過凍融輔助破壁和再次微波處理后，進行菌落PCR可達到相比其他預處理方式更優(yōu)的檢測效果(圖3f、4f).

培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)物的生長周期均可成為影響酵母菌落PCR檢測效率的因素[18]，本研究選取不同生長時期的酵母菌液進行微波凍融處理，后續(xù)的PCR檢測結(jié)果并無明顯差異.對于微波凍融法制備的模板，控制相同模板量，使用10 μL反應體系亦可得到相同的檢測結(jié)果.因此，微波凍融法受培養(yǎng)基以及菌體生長周期的影響較小，相比其他預處理方式更占優(yōu)勢.在釀酒酵母大規(guī)模DNA片段組裝后的鑒定中，以長鏈DNA片段為靶標可以提高檢測準確度，同時能夠助力測序驗證工作的高效運行.本研究使用微波凍融法擴增長鏈DNA片段，所得電泳條帶明亮且單一，表明該方法的條件溫和且對細胞DNA的破壞較小，適用于長鏈DNA片段的檢測.

4 結(jié)論

本研究從菌落PCR常規(guī)的物理預處理方式出發(fā)，通過對比各種方法的異同之處，提出使用微波凍融法制備的模板進行釀酒酵母菌落PCR檢測，該方法操作簡單、耗時短、條件較為溫和、破壁效果顯著，不僅可在不同基因操作體系中高效擴增短鏈DNA，且適用于3 000 bp以上長鏈DNA片段的檢測.此外，在巴斯德畢赤酵母和樹干畢赤酵母中使用微波凍融法制備的模板進行菌落PCR均可實現(xiàn)較好的檢測效果.綜上所述，微波凍融法的應用降低了檢測成本，提高了檢測效率，適合應用在復雜酵母菌落PCR檢測.