松材線蟲VAP家族成員結(jié)構(gòu)分析

潘佳亮, 王巧申, 李長強(qiáng), 李理櫟, 姚洪錫, 閻 合

(1.國家林業(yè)和草原局生物災(zāi)害防控中心/林業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)預(yù)警國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 沈陽 110034；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040；3.榮成市國有成山林場(chǎng)，山東 榮成 264300)

松材線蟲病(pine wilt disease, PWD)是由病原松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的重大森林病害[1-3].該病害自1982年首次在我國南京市中山陵風(fēng)景區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，迅速傳播蔓延，目前已擴(kuò)散至我國19個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)731個(gè)縣級(jí)行政區(qū)，侵染111.46萬hm2松林，僅2020年就造成近2 000萬株松樹死亡，造成的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計(jì)[4-5].目前,防治松材線蟲病的方法主要包括嚴(yán)格實(shí)行檢疫、清理病死樹、化學(xué)藥劑毒殺媒介昆蟲松墨天牛(Monochamusalternatus)和病原松材線蟲、培育抗病樹種等[2].但有關(guān)松材線蟲的致病機(jī)制尚不明確.

類毒液過敏原蛋白(venom allergen-like protein, VAP)是一類在動(dòng)物和植物線蟲體內(nèi)廣泛存在的分泌蛋白家族.研究表明，植物寄生線蟲食道腺細(xì)胞分泌物在線蟲侵染寄主植物組織早期起到了十分重要的作用，編碼此類分泌蛋白的基因被認(rèn)為是線蟲的致病基因[6-7].VAP基因參與線蟲與寄主植物的互作過程，目前學(xué)者們已完成了大豆包囊線蟲(Heteroderaglycines)[8]、馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)[9-10]、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)[11-12]、花生莢線蟲(D.africanus)[13]、松材線蟲[14-15]等植物寄生線蟲體內(nèi)部分相關(guān)基因的鑒定.Kang et al[16]研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲分泌的VAP基因與其遷移行為顯著相關(guān)，這表明VAP基因可能參與調(diào)控松材線蟲在寄主松樹內(nèi)的早期寄生行為. Wilbers et al[17]研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物和植物寄生線蟲和自由生活線蟲VAP基因無明顯區(qū)別，且均具有約15 ku富含半胱氨酸的CAP(代謝產(chǎn)物活化蛋白，catabolite activator protein)結(jié)構(gòu)域，可能是VAP的穩(wěn)定分子支架.馮宇倩等[18]對(duì)4個(gè)Bx-VAPs功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)Bx-VAPs均具有SCP(精子包被蛋白，sperm-coating protein)結(jié)構(gòu)域，屬于SCP/TAPS蛋白(精子包被蛋白的Tpx-1/Ag-5/Pr-1/Sc-7, sperm-coating protein/Tpx-1/antigen-5/pathogenesis related-1/Sc-7).

本研究基于隱桿線蟲屬線蟲VAP基因的相關(guān)報(bào)道，篩選鑒定出了14個(gè)松材線蟲VAP家族成員(Bx-VAPs)蛋白同源序列，并對(duì)其生物信息學(xué)特性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，旨在為進(jìn)一步研究松材線蟲其余基因的功能和VAP在松材線蟲寄生過程中的作用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 Bx-VAPs基因篩選鑒定及理化特性測(cè)定

在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載了隱桿線蟲屬線蟲(Caenorhabditisbriggsae、C.elegans、C.remanei)的全部VAP基因，以隱桿線蟲屬VAP家族氨基酸序列作為檢索對(duì)象，通過Wormbase數(shù)據(jù)庫(https://wormbase.org)[19]與松材線蟲的基因組數(shù)據(jù)[20]進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出松材線蟲VAP同源序列.

利用ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)[21]對(duì)Bx-VAPs的氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、脂肪指數(shù)、分子結(jié)構(gòu)式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，然后通過CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[22]對(duì)Bx-VAPs 保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè).應(yīng)用Mega 7軟件中的鄰位連接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建Bx-VAPs的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，然后再使用bootstrap法驗(yàn)證樹的可靠性并給出一棵自展一致樹(bootstrap consensus tree)，自展重復(fù)抽樣檢驗(yàn)達(dá)1 000次[23].

1.2 蛋白質(zhì)序列基序分析

Bx-VAPs蛋白基序可以先通過MEME工具(https://meme-suite.org/meme/)[24]進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，再通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)[25]和InterPro數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)[26]進(jìn)行注釋.

1.3 疏水性和跨膜螺旋區(qū)域分析

應(yīng)用ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)[27]預(yù)測(cè)Bx-VAPs疏水性；應(yīng)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和PSORTb(http://www.psort.org/psortb/)對(duì)Bx-VAPs跨膜螺旋區(qū)進(jìn)行分析[28]；通過Protter網(wǎng)站(http://wlab.ethz.ch/protter/start/)預(yù)測(cè)Bx-VAPs的拓?fù)洚悩?gòu)模型[29].

1.4 磷酸化位點(diǎn)分析

應(yīng)用NetPhos 3.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[30]對(duì)Bx-VAPs的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行分析.

1.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

應(yīng)用SOPMA工具(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)[31]預(yù)測(cè)Bx-VAPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[32]對(duì)Bx-VAPs三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模.

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx-VAPs基因的鑒定及理化性質(zhì)

基于Wormbase數(shù)據(jù)庫比對(duì)篩選的結(jié)果見表1，在松材線蟲全基因組中找到與其他線蟲VAP同源的基因共14個(gè)，將其依次命名為BXY-VAP1～BXY-VAP14.

表1 Bx-VAPs與其他線蟲VAP對(duì)照表

由表2可見，不同Bx-VAPs氨基酸數(shù)量差異顯著，區(qū)間為175～295個(gè)，平均氨基酸數(shù)量為221.79個(gè).Bx-VAPs相對(duì)分子質(zhì)量為19 449.19～30 731.72，平均為24 493.77.這14個(gè)基因的蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為4.29～9.40，脂肪系數(shù)為56.07～82.40，表明Bx-VAPs的熱穩(wěn)定性存在顯著差異.蛋白質(zhì)親水系數(shù)均為負(fù)值，分布在-0.682～-0.070之間，說明14個(gè)Bx-VAPs基因均為疏水蛋白.這14個(gè)蛋白質(zhì)均由C、H、N、O和S 5種原子組成，原子總數(shù)分布在2 693～4 216個(gè)之間.蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為19.62～54.71，其中11種Bx-VAPs的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而BXY-VAP3、BXY-VAP8和BXY-VAP9的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差.

表2 Bx-VAPs理化性質(zhì)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及蛋白質(zhì)基序

由圖1可見，松材線蟲VAP1、VAP2、VAP3、VAP13聚為一支，VAP10、VAP11和眼線蟲(Loaloa)VAP聚為一支，VAP6、VAP7、VAP8、VAP14聚為一支，VAP4和VAP9聚為一支，VAP5和VAP12聚為一支，同一支上的蛋白可能表現(xiàn)相似的功能.

BXY、LOAG、CE、CRE、CBR分別表示松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、眼線蟲(Loa loa)、秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)、C.remanei、C.briggsae.

14個(gè)Bx-VAPs基因家族都含有保守基序2和基序4，表明這兩個(gè)基序在松材線蟲VAP家族中保守；進(jìn)化關(guān)系相近的Bx-VAPs含有相同或相似的蛋白質(zhì)基序，如基序6和基序7都僅存在于BXY-VAP6、BXY-VAP7、BXY-VAP14中(圖2).對(duì)獲得的10個(gè)保守的蛋白質(zhì)基序在Pfam和InterPro上進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)所有序列均為CAP家族成員，基序1和基序2為CAP結(jié)構(gòu)域，其他基序未獲得注釋結(jié)果.

圖2 Bx-VAPs的蛋白質(zhì)基序示意圖

2.3 蛋白質(zhì)疏水性及跨膜螺旋區(qū)分析

Bx-VAPs包含多個(gè)親水性和疏水性區(qū)域，其聚集現(xiàn)象并不顯著.以BXY-VAP2為例，其第 194位精氨酸(R)的疏水性分值低(-2.867)，表明其具有很高的親水性；但第8位亮氨酸(L)的疏水性分值較高(1.733)，表明具有疏水性(表3).進(jìn)一步通過TMHMM對(duì)蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員除VAP5和VAP11外，均屬于胞外蛋白，且不存在跨膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu).

表3 Bx-VAPs疏水性分析1)

2.4 拓?fù)洚悩?gòu)模型預(yù)測(cè)

由表4可見，14個(gè)Bx-VAPs的氨基酸數(shù)量相近，分布在175～295個(gè)之間，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有0～5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)數(shù)量差異較大，酪氨酸(Y)數(shù)量接近.其中，BXY-VAP2具有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，BXY-VAP3、BXY-VAP4、BXY-VAP11、BXY-VAP13、BXY-VAP14均具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖3).研究證明，N-糖基化位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸起重要作用[33]，從側(cè)面說明Bx-VAPs具有分泌蛋白的特性.此外，BXY-VAP5和BXY-VAP11沒有信號(hào)肽，因此，除這兩個(gè)蛋白以外均為分泌蛋白.

表4 Bx-VAPs拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

通過對(duì)Bx-VAPs二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表5)發(fā)現(xiàn)，14個(gè)Bx-VAPs蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)不同，其中，無規(guī)則卷曲(32.95%～56.57%)、α-螺旋(16.57%～47.73%)和β-折疊(10.84%～21.71%)3種結(jié)構(gòu)的占比較高，β-轉(zhuǎn)角(1.47%～11.83%)結(jié)構(gòu)的占比較低.因而推測(cè)Bx-VAPs二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊起決定作用.三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果(圖4)表明，松材線蟲VAP1、VAP3、VAP4、VAP6、VAP7、VAP12和VAP14結(jié)構(gòu)相似，而VAP2、VAP5、VAP8、VAP10和VAP13結(jié)構(gòu)相似.結(jié)合蛋白拓樸結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，除VAP5和VAP11外，其他Bx-VAPs三級(jí)結(jié)構(gòu)均有明顯的胞外蛋白形態(tài)特征.

表5 Bx-VAPs中構(gòu)成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量分析

3 討論

VAP作為一種高度保守的線蟲分泌物，可以抑制受傷的寄主植物組織激活自身防御系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)寄主植物因寄生線蟲危害而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[34].研究表明，在寄生線蟲各寄生階段VAP基因表達(dá)均發(fā)生特異性上調(diào)[35-38].本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了松材線蟲VAP家族成員結(jié)構(gòu)，可為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平上揭示松材線蟲的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ).

線蟲在寄生過程中VAP在結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守，植物和動(dòng)物寄生線蟲VAP基因序列無顯著差異[17].因此，可以利用已知線蟲的VAP基因定位其他線蟲的VAP基因，進(jìn)而對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證.本研究基于隱桿線蟲屬線蟲的基因共鑒定到14個(gè)松材線蟲VAP家族基因，盡管不同Bx-VAPs氨基酸組成數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量存在很大的差異，但在進(jìn)化上相對(duì)保守，與其他線蟲[17]相似.

線蟲VAP家族被歸類為SCP/TAPS蛋白，其核心是一個(gè)結(jié)構(gòu)保守的約15 ku富含半胱氨酸的CAP結(jié)構(gòu)域，具有類似α-β-α的三明治結(jié)構(gòu)，其保守、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特性有利于不同種類線蟲對(duì)寄主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[8,39-41].本研究中，α-螺旋和β-折疊是松材線蟲VAP家族成員的重要組成部分，且所有蛋白均含有CAP結(jié)構(gòu)域，具有明顯的胞外蛋白形態(tài)特征，該結(jié)構(gòu)可能是松材線蟲調(diào)節(jié)寄主免疫應(yīng)答的重要功能位點(diǎn).

線蟲侵入動(dòng)物和植物后，會(huì)在宿主組織中遷移、繁殖，并以宿主細(xì)胞為食，對(duì)宿主造成嚴(yán)重?fù)p害[42-43].在此過程中，線蟲會(huì)通過調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答過程而限制宿主對(duì)其造成的傷害，創(chuàng)造適合自身生存的環(huán)境[42,44-45]，VAP在其中發(fā)揮著重要的作用.然而，目前針對(duì)松材線蟲VAP家族的研究較少.未來應(yīng)該從松材線蟲和寄主植物兩個(gè)方面加強(qiáng)對(duì)VAP家族的研究，為明確松材線蟲入侵機(jī)制和開展植物抗性育種工作奠定基礎(chǔ).