氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法測定辣椒中咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚

李 萍，徐蓓蓓，鄭欽月，王路路，劉文芳

（1.柘城縣綜合檢驗(yàn)檢測中心，河南 商丘 476200；2.中檢集團(tuán)中原農(nóng)食產(chǎn)品檢測（河南）有限公司，河南 鄭州 450000）

咪鮮胺作為一種廣譜咪唑類殺菌劑，對辣椒枯萎病具有很好的防治效果[1]，因此被廣泛應(yīng)用于辣椒的種植及采摘保鮮中。咪鮮胺進(jìn)入環(huán)境后，會生成代謝產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚，其具有顯著的毒理學(xué)效應(yīng)和潛在致癌性，可對人類神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)造成不良影響，如引起慢性支氣管炎、咳嗽和肺功能改變等[2]。2,4,6-三氯苯酚已經(jīng)被美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）列為優(yōu)先污染物，在我國也被確定為水體中的優(yōu)先污染物[3]。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]中規(guī)定辣椒中咪鮮胺的最大殘留限量為2 mg/kg，殘留量以咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚之和計(jì)。但目前的檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)僅有NY/T 1456—2007《水果中咪鮮胺殘留量的測定 氣相色譜法》[5]，且該標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍不包括辣椒及其他蔬菜。

咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的檢測分析方法有光譜法[6]、電化學(xué)法[7]、氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-16]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-19]。光譜法、電化學(xué)法、氣相色譜法、液相色譜法樣品的前處理不僅復(fù)雜繁瑣，且還會用到毒性較大的吡啶鹽酸鹽，不利于檢驗(yàn)人員的健康和環(huán)境的安全，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對設(shè)備要求比較高。氣相色譜-質(zhì)譜法檢測咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚時(shí)常采用電子轟擊離子源（Electron ionization，EI）。由于EI源不具有選擇性，分析物容易受到多雜質(zhì)干擾，易造成假陽性。研究表明，化學(xué)離子源（Chemical ionization，CI）對特定基團(tuán)的化合物也具有較好的電離效果。比如負(fù)化學(xué)離子源（Negative chemical ionization，NCI）具有較弱的電離性，產(chǎn)生的碎片離子少，對含鹵原子具有較好的選擇性和較高的靈敏度[20]。同時(shí)，正化學(xué)離子源（Positive chemical ionization，PCI）對于含氮雜環(huán)化合物有響應(yīng)，而對很多雜質(zhì)沒有響應(yīng)，從而可以消除多數(shù)無法離子化雜質(zhì)的干擾，不易出現(xiàn)假陽性[21]。由于咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚分子結(jié)構(gòu)中含氮雜環(huán)以及電負(fù)性氯原子（圖1），因此具有NCI電離的可能性。本文通過采用不同的離子源和化學(xué)電離源研究同時(shí)測定辣椒中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的方法，以期獲得良好的靈敏度和選擇性，降低假陽性。

圖1 咪鮮胺（A）及2,4,6-三氯苯酚（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophenol(B)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

辣椒，市售；咪鮮胺（標(biāo)準(zhǔn)品濃度100μg/mL）、2,4,6-三氯苯酚（標(biāo)準(zhǔn)品濃度100μg/mL），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；丙酮（色譜純），德國Merck公司。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（Primary secondary amine,PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black,GCB）、陶瓷均質(zhì)子、有機(jī)微孔濾膜（孔徑0.45μm），美國Agilent公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7200氣相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；AB204 N電子天平（精確至0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜參數(shù)

色譜柱：VF-1701 ms（30 m×250μm×0.25μm）；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣口溫度：260℃；恒流模式，流速1.2 mL/min；傳輸線溫度：280℃；程序升溫：初溫60℃，30℃/min升至280℃，280℃保持8 min。

1.2.2 質(zhì)譜參數(shù)

負(fù)化學(xué)離子源，離子源溫度150℃，發(fā)射電流20.0μA，電子能量250.0 eV，質(zhì)譜采集模式Scan，采集范圍35～500 u，采集頻率2 Spec/s。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以丙酮為溶劑，分別移取咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配成兩種10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再稀釋至質(zhì)量濃度0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 凈化方式的篩選

稱取10 g辣椒，加入10 mL乙腈，均質(zhì)后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中分別加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，凈化管中均加入300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機(jī)濾膜，取1 mL分別加入0.2μg咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述儀器條件測定。測定結(jié)果分別計(jì)為B-PSA、B-C18、B-GCB。

稱取10 g辣椒，分別加入2μg咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，加入10 mL乙腈，均質(zhì)后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中分別加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，凈化管中均加入300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機(jī)濾膜，待測。測定結(jié)果分別計(jì)為C-PSA、C-C18、C-GCB。

以丙酮為溶劑分別配制0.2μg/mL咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，待測。測定結(jié)果計(jì)為A。

以上測定結(jié)果均以定量離子峰面積表示。

凈化方式通過基質(zhì)效應(yīng)和回收率評價(jià)?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算參照Matuszewski等[22]的方法。

式中：ME為前處理過程總基質(zhì)效應(yīng)，%；B為目標(biāo)化合物在陰性樣品處理液基質(zhì)中檢測的峰面積；A為目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測的峰面積；RE為前處理過程回收率，%；C為目標(biāo)化合物經(jīng)過前處理后處理液基質(zhì)中檢測的峰面積；PE為折算回收率后的基質(zhì)效應(yīng)，%。

1.2.5 定性定量計(jì)算

采用“1.2.2”質(zhì)譜參數(shù)中NCI采集。咪鮮胺定量離子m/z為163.063 3，定性離子m/z為161.065 5；2,4,6-三氯苯酚定量離子m/z為196.045 2，定性離子m/z為160.057 4，基質(zhì)外標(biāo)法定量。

1.2.6 線性范圍和定量限的測定

在空白辣椒基質(zhì)中分別添加0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述儀器條件測定。以物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，定量離子豐度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，確定線性范圍。

稱取10 g沒有檢出咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分別加入咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚混標(biāo)，添加水平均為0.1、0.2、0.5μg/mL，加入10 mL乙腈，均質(zhì)后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中加入100 mg C18和300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測試，結(jié)果以10倍信噪比確定定量限。

1.2.7 精密度和準(zhǔn)確性的測定

稱取10 g未檢出咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分別添加不同含量水平（0.05、0.20、1.00 mg/kg）咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚混標(biāo)，進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確性驗(yàn)證，精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率表示，每個(gè)濃度重復(fù)測定3次（n=3）。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚質(zhì)譜采集模式的研究

以丙酮為溶劑分別配成5μg/mL咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用“1.2.1”中的氣相色譜參數(shù)采集，獲得咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的色譜圖（圖2）。由圖2可以看出，咪鮮胺的保留時(shí)間為13.396 min，2,4,6-三氯苯酚的保留時(shí)間為5.177 min，分離效果較好。咪鮮胺在NCI模式下的特征離子m/z主要為163.063 3（定量離子）、161.065 5（定性離子）；2,4,6-三氯苯酚在NCI模式下的特征離子m/z主要為196.045 2（定量離子）、160.057 4（定性離子）。

圖2 NCI模式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard samples of prochloraz and 2,4,6-trichlorophphenol in NCI mode

2.2 凈化吸附劑對咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚提取效果的影響

基質(zhì)效應(yīng)抑制率高，回收率接近100%，則認(rèn)為凈化效果好。RE值接近100%，說明吸附劑對目標(biāo)物產(chǎn)生的吸附效果弱；RE值較低，說明吸附劑對目標(biāo)物產(chǎn)生的吸附效果強(qiáng)，目標(biāo)物回收率低。不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚峰面積測定結(jié)果見表1，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算結(jié)果見表2。由表2可知，咪鮮胺經(jīng)過PSA、C18處理，RE值接近100%，幾乎沒有被吸附；經(jīng)GCB處理，RE值僅17.7%，說明GCB對咪鮮胺產(chǎn)生較強(qiáng)吸附。2,4,6-三氯苯酚經(jīng)過C18處理，RE值接近100%，經(jīng)PSA、GCB處理，RE值分別為33.2%、58.2%，說明GCB對2,4,6-三氯苯酚也產(chǎn)生較強(qiáng)吸附，與咪鮮胺相比，2,4,6-三氯苯酚極性大，而PSA能夠消除極性雜質(zhì)。

表1 不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚峰面積測定結(jié)果Table 1 Results of determination of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments

表2 不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments 單位：%

綜上所述，在同時(shí)檢測咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚時(shí)，可使用C18處理親脂性雜質(zhì)，使用PSA、GCB可能造成回收率降低。C18處理后咪鮮胺ME值為119.4%，2,4,6-三氯苯酚ME值為157.5%，說明都產(chǎn)生了基質(zhì)放大效應(yīng)。因此本研究使用C18作為凈化吸附劑，為降低基質(zhì)效應(yīng)干擾，定量使用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量。

2.3 定量限和線性范圍

由圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚在0.01～1μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程分別為：y=2 284x-4.217 8，y=402 327x-1 617.9，R2分別為0.999 5、0.999 1，說明擬合度較好。

圖3 咪鮮胺(A)和2,4,6-三氯苯酚(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophphenol(B)

結(jié)果表明，加標(biāo)濃度0.05 mg/kg時(shí)，咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚混標(biāo)定量離子信噪比均大于10，因此，咪鮮胺及2,4,6-三氯苯定量限均為0.05 mg/kg。

2.5 精密度和準(zhǔn)確性

由表3可見，在添加水平0.05～1.00 mg/kg范圍內(nèi)，咪鮮胺在辣椒中的回收率為85.0%～92.3%，RSD為0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚的回收率為82.3%～96.4%，RSD為0.8%～1.7%。表明該方法準(zhǔn)確性、精密度良好。

表3 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚加標(biāo)回收率及精密度Table 3 Spike recovery and precision of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

3 結(jié)論與討論

采用氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法研究了咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的檢測方法，結(jié)果表明：NCI模式下，對咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的定量限均為0.05 mg/kg；研究對比了凈化吸附劑PSA、C18和GCB的凈化效果，由于PSA和GCB對咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚產(chǎn)生較強(qiáng)吸附，因此最終選擇C18為前處理凈化吸附劑；在添加水平0.05～1.00 mg/kg范圍內(nèi)，咪鮮胺在辣椒中的回收率為85.0%～92.3%，RSD為0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚在辣椒中的回收率為82.3%～96.4%，RSD為0.8%～1.7%。該方法準(zhǔn)確性、精密度良好，且簡單、快速、高效，可用于同時(shí)對咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的定性和定量分析。