基于HMGB1-TLR4 信號通路探討黃芩甲苷對DDC誘導膽汁淤積性肝病小鼠的保護作用研究

胡 嘯，劉 蓋

（廣東省第二人民醫(yī)院普外二科，廣東 廣州 510317）

膽汁淤積癥是由于機體膽汁形成和分布障礙導致的膽汁酸在肝細胞和膽管大量蓄積，臨床上主要有以下三種膽汁淤積癥：①原發(fā)性硬化性膽管炎，②原發(fā)性膽汁性膽管炎，③各型病毒性肝炎所致的膽汁淤積[1]。多種膽汁淤積癥均可導致膽汁淤積性肝病的發(fā)生，如不及時有效治療，甚至可能進展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝腫瘤[2]。近年來流行病學證據(jù)顯示我國膽汁淤積性肝炎的發(fā)生率占慢性肝病患者的10%以上[3]。其病因尚不明確，藥物、毒物、酒精、病毒、自身免疫等均與其密切相關[4]。然而，臨床上治療藥物仍然十分匱乏，患者的預后不理想。截至目前，熊去氧膽酸是唯一經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療膽汁淤積的藥物，其不良反應逐漸被報道，如50%患者對熊去氧膽酸不產(chǎn)生藥效學反應，長期服用的患者常出現(xiàn)皮膚瘙癢、腹瀉等不良反應[5]。

黃芪，性味微溫、甘，是膜莢黃芪和蒙古黃芪的根，其具有利水消腫、補氣升陽和固表止汗等功效[6]。在臨床治療肝纖維化方面，黃芪發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，從黃芪中提取的單體以及單味藥均呈現(xiàn)較強的抗肝纖維化活性[7]。黃芪甲苷是其主要的活性成分，具有廣譜的藥理活性，包括增強免疫力、抗氧化損傷、抗炎、抗衰老、抗病毒等[8]。黃芪甲苷是否為黃芪主要的護肝有效成分之一，其是否對DSS 誘導膽汁淤積性肝病小鼠具有較好的保護作用未見定論。近年來，高遷移族蛋白B1-Toll 樣受體4（HMGB1-TLR4）信號通路在多種炎癥性疾病發(fā)病過程中的作用逐漸受到重視。已有研究證據(jù)表明HMGB1-TLR4信號通路在膽汁淤積性肝損傷大鼠模型中顯著上調[9]。此外，有研究證據(jù)顯示黃芪甲苷通過抑制HMGB1/TLR4通路，降低多種促炎因子的水平，從而改善過敏性鼻炎的癥狀[10]。本實驗擬通過自由喂食0.1% 3,5- 二乙氧基羰基-1,4- 二氫-2,4,6- 三甲基吡啶（DDC）飼料建立小鼠膽汁淤積性肝病模型，以HMGB1-TLR4 信號通路為切入點，初步探討黃芪甲苷對膽汁淤積性肝病小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑與儀器黃芪甲苷，購于武漢克米克生物醫(yī)藥技術有限公司（純度≥99%）；熊去氧膽酸膠囊，購于德國Losan Pharma GmbH（批號：15A10039L）；DDC，購于Sigma 公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL） -1β 和IL-6 檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、直接膽紅素（D-BIL）、間接膽紅素（I-BIL）、總膽汁酸（TBA）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）檢測試劑盒，購于南京建成生物有限公司；HMGB1 和TLR4單克隆抗體，購于abcam 公司。HS-S7220 型輪轉石蠟切片機，購于沈陽恒松科技有限公司，HM-SY96A 酶標儀，購于山東恒美電子科技有限公司；六一DYY6D 電腦三恒電泳儀，購于濟南來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.2 動物分組與給藥從北京華阜康生物科技股份有限公司購買40 只2 月齡雄性C57BL/6 小鼠（18～22 g），其許可證號：SCXK（京）2019-0008。小鼠正常飲食1 周后，按體重隨機分為正常對照組（10 只）、模型組（10 只）、熊去氧膽酸組（UDCA 組，100 mg/kg，10 只）和黃芩甲苷組（HQJG 組，40 mg/kg，10 只）。小鼠自造模5 d 后，通過灌胃方式給藥，連續(xù)灌胃給藥3 d，其中正常對照組和模型組小鼠以生理鹽水作為對照。本實驗經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過。

1.3 小鼠膽汁淤積性肝病模型建立小鼠膽汁淤積性肝病模型的構建方法[11]如下：小鼠自由喂養(yǎng)含有0.1%DDC 飼料，連續(xù)喂養(yǎng)5 d，構建小鼠膽汁淤積性肝病模型，正常對照組自由喂養(yǎng)普通基礎飼料5 d。

1.4 肝組織病理形態(tài)學觀察取肝組織，10%甲醛浸泡固定24 h 后，切取肝組織大概2 mm，流水沖洗過夜，然后分別浸泡70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇，各5 h。接著使用二甲苯透明2 min，組織置于60 ℃的石蠟溶液1 h，包埋后，待石蠟冷卻凝固后切片，設定切片厚度為4 μm。對肝組織切片進行常規(guī)HE 染色，使用光學顯微鏡觀察。

1.5 肝組織勻漿炎癥因子與氧化應激指標檢測取適量肝組織并加入適量的生理鹽水，使用玻璃勻漿器于冰上研磨，最終制備10%肝組織勻漿，設定離心機參數(shù)：3 500 r/min，4 ℃，離心15 min，隨后分離上清液并保存。對肝組織勻漿中SOD、GSH-PX 的活力以及TNF-α、IL-6、IL-1β 和MDA 的水平進行檢測。

1.6 血清膽紅素、膽汁酸以及肝功能酶水平檢測麻醉小鼠（2%戊巴比妥鈉），通過摘眼球方式取血，將血液置于4 ℃冰箱中2 h，4 ℃、3 500 r/min 離心15 min，分裝血清，對血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA、ALT、AST 和ALP水平進行檢測。

1.7 肝組織HMGB1 和TLR4 蛋白表達水平檢測制備15%的SDS-PAGE 電泳膠，每孔的上樣量為50 μg，SDSPAGE 電泳分離蛋白，隨后按120 V，100 min 轉PVDF 膜，PBST 洗膜3 次，15 min/次，5%的脫脂奶粉室溫于搖床中孵育PVDF 膜2h，PBST 洗膜5 次，15 min/次，倒入一抗按1∶2000 稀釋后孵育過夜，（p-GSK-3β）、PI3K、AKT 和β-actin，PBST 洗膜5 次，15 min/次，倒入二抗并室溫搖床中孵育1 h，PBST 洗膜3 次，15 min/次，ECL 試劑顯影后，曝光和拍照。

1.8 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件。以(±s)表示計量資料，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝組織病理形態(tài)學變化正常對照組肝細胞排列整齊、清晰（圖1-A）；模型組可見肝細胞壞死區(qū)域較大，炎性細胞浸潤較多，（圖1-B）。黃芪甲苷組和熊去氧膽酸組肝組織上述病理學改變明顯改善，見圖1-C、D。

圖1 肝組織病理學變化（HE，200×）

2.2 肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 水平 由圖2 可見，模型組小鼠肝組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯較正常對照組高（P＜0.01）。而黃芩甲苷組和熊去氧膽酸組小鼠肝組織IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平明顯較模型組低（P＜0.01）。

圖2 肝組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平 (±s, n=10)

2.3 肝組織SOD、GSH-PX活力和MDA 水平 由圖3 可見，與正常對照組相比較，模型組小鼠肝組織MDA 水平明顯升高（P＜0.01），而SOD 和GSH-PX 活力明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，黃芩甲苷組和熊去氧膽酸組肝組織MDA 水平明顯降低（P＜0.01），SOD 和GSH-PX 活力明顯升高（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠肝組織SOD、GSH-PX 活力和MDA 水平 ( ±s, n=8)

2.4 血清膽紅素和膽汁酸水平由圖4 結果可見，模型組小鼠較正常對照組小鼠血清的D-BIL、I-BIL、TBA 和T-BIL 水平明顯升高（P＜0.01）。黃芩甲苷組和熊去氧膽酸組較模型組小鼠血清的D-BIL、I-BIL、TBA 和T-BIL 水平明顯降低（P＜0.01）。

圖4 血清T-BIL、D-BIL、I-BIL 和TBA 水平 ( ±s, n=10)

2.5 各組小鼠血清肝功能酶的影響由圖5 可見，模型組小鼠血清肝功能酶AST、ALP 和ALT 水平明顯比正常對照組高（P＜0.01）。黃芪甲苷組和熊去氧膽酸組血清肝功能酶AST、ALP 和ALT 水平明顯比模型組低（P＜0.01）。

圖5 各組小鼠血清ALT、AST 和ALP 水平 ( ±s, n=10)

2.6 各組小鼠肝組織HMGB1和TLR4 蛋白表達水平

與正常對照組比較，模型組肝組織的HMGB1 和TLR4 的蛋白表達量明顯上調（P＜0.01）。與模型組比較，黃芪甲苷組和熊去氧膽酸組肝組織的HMGB1 和TLR4 的蛋白表達量明顯下調（P＜0.01），見圖6。

圖6 肝組織HMGB1 和TLR4 蛋白表達水平 ( ±s, n=6)

3 討論

膽汁淤積性肝病是一種由多種復雜因素所引發(fā)的膽汁形成、分泌和排泄異常從而導致的肝病。如肝內膽汁酸的代謝和轉運出現(xiàn)異常，則可引發(fā)膽汁的大量淤積并入血，從而引起血中GGT和ALP等的升高，嚴重者還可出現(xiàn)高膽紅素血癥。由于膽汁淤積性肝病發(fā)病相對隱匿，早期癥狀難發(fā)現(xiàn)，此外，其特異度較低的臨床表現(xiàn)，誤診或漏診常有發(fā)生。膽汁在肝臟中的大量滯留是膽汁淤積性肝損傷的主要發(fā)生機制，故降膽汁藥是臨床上常用的治療藥物。目前，膽汁淤積性肝病的治療藥物主要有熊去氧膽酸和奧貝膽酸[12]?？蒲猩希珼DC 誘導動物膽汁淤積性肝病模型是一種以異生素誘導的膽汁淤積新模型，其機制可能與增加膽管上皮細胞的膽汁分泌增加有關，還可誘導骨橋蛋白、血管細胞黏附分子和促炎因子表達，導致膽管損傷和膽汁積累，是一種穩(wěn)定性較高的膽汁淤積模型[13]。故本研究選用自由喂食0.1% DDC 飼料建立小鼠膽汁淤積性肝病模型，以熊去氧膽酸為陽性對照藥，基于HMGB1-TLR4 信號通路探討黃芪甲苷對膽汁淤積性肝病小鼠的藥效及機制。

炎癥與氧化應激損傷參與了膽汁淤積性肝病發(fā)生發(fā)展過程，有研究表明急性和慢性肝炎患者中，血清促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明顯升高，而SOD 活力明顯降低，MDA 水平明顯升高[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩甲苷可顯著降低肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 和MDA 水平，明顯升高肝組織SOD 和GSH-PX 活力，表明黃芩甲苷可抑制膽汁淤積性肝炎的炎癥和氧化應激損傷，阻礙疾病的發(fā)生發(fā)展。臨床上，膽汁淤積性肝炎患者血清膽紅素、肝功能酶和膽汁酸水平常有升高，故臨床上常通過檢測上述指標作為評價患者肝膽功能的好壞[16]。本研究結果表明，黃芩甲苷能明顯降低血清T-BIL、D-BIL、I-BIL TBA、ALT、AST和ALP 的水平，提示黃芩甲苷可能通過降低血清膽紅素、膽汁酸和肝功能酶水平，從而改善肝膽功能。此外，黃芩甲苷還可減少肝細胞壞死區(qū)域，減少炎癥細胞浸潤，改善膽汁淤積性肝病的癥狀。HMGB1-TLR4 信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關的重要信號通路之一[17]。HMGB1 是機體內一種重要的促炎性細胞因子，是TLR4生理配體之一，與TLR4 結合，進一步激活下游信號因子MyD88，引起IκBα 磷酸化，促進NF-κB 的解離，隨即進入細胞核，與系列靶基因結合，促進相關炎性因子的大量表達，引發(fā)機體內炎癥反應過程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩甲苷可明顯降低肝組織HMGB1 和TLR4 的蛋白表達，表明黃芩甲苷通過調節(jié)HMGB1-TLR4 信號通路，抑制膽汁淤積性肝病的炎癥過程。

綜上所述，黃芩甲苷通過抗炎、抗氧化應激損傷以及調節(jié)HMGB1-TLR4 信號通路對膽汁淤積性肝病小鼠具有較好的保護作用。