維生素A對(duì)黃鱔生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)氨酶活性和肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

胡重華，張文平，霍歡歡，安雨琪，黃廣華，梁立文，周磊濤，周秋白

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/南昌市特色水生生物營(yíng)養(yǎng)生理與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

【研究意義】維生素A 是一種脂溶性維生素，在動(dòng)物的細(xì)胞分化和增殖、生長(zhǎng)、視覺、應(yīng)激、免疫、生殖、胚胎發(fā)育和健康維持等許多重要的生物過程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。水產(chǎn)動(dòng)物和其他動(dòng)物一樣，自身不能合成維生素A，需要依賴食物提供維生素A 或其前體—類胡蘿卜素[4]。維生素A 缺乏或過量都會(huì)影響魚類的健康及正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致魚體出現(xiàn)維生素A 缺乏或中毒癥狀。飼料維生素A 缺乏時(shí)花鱸（Lateolabrax japonicus）[5]、尼羅羅非魚幼魚（Oreochromis niloticus）[6-7]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[8]及比目魚（Hippoglossus hippoglossusL.）[9]表現(xiàn)出生長(zhǎng)減緩、死亡率升高、眼球膨脹、鰭基和皮膚充血、鰓蓋扭曲和脊柱歪曲等典型缺乏癥狀。維生素A過量會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡率增加、脊椎生長(zhǎng)異常和生長(zhǎng)減緩等癥狀[7,10]。攝入高維生素A水平飼料時(shí)，牙鲆幼魚[11-12]表現(xiàn)出生長(zhǎng)受阻、體長(zhǎng)變短及骨骼畸形等癥狀，虹鱒[13]、羅非魚[7]和牙鲆[14]的肝臟表現(xiàn)出脆弱和蒼白?！厩叭搜芯俊磕壳?，有關(guān)魚類對(duì)飼料維生素A需求量的報(bào)道較多，如吉富羅非魚（Oreochromis nilooticus）需求量2 954.84 IU/kg[15]、青魚幼魚（Mylopharyngodon piceus）需求量2 246.64 IU/kg[16]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）適宜添加水平為33 705～40 316 IU/kg[17]、武昌魚幼魚（Megalobrama amblycephala）需求量為3 914 IU/kg[18]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）需求量為2 500～3 500 IU/kg[19]。鯉（Cyprinus carpio）需求量在4 000～20 000 IU/kg[20-21]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）需求量在10 000 IU/kg以上[22]。【研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)黃鱔營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究已有較多報(bào)道，但主要集中在黃鱔蛋白質(zhì)及脂肪需求方面[23-29]，有關(guān)維生素A的研究未見報(bào)道?！緮M解決問題】本試驗(yàn)以（2.64±0.03）g 人工黃鱔苗為試驗(yàn)動(dòng)物，探究飼料中維生素A 對(duì)黃鱔生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)及肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響，旨在探究黃鱔對(duì)飼料維生素A 的需求，以期為黃鱔人工飼料的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料

試驗(yàn)分為7組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)行50尾。試驗(yàn)所用黃鱔選自于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，均為人工繁殖黃鱔苗，平均體質(zhì)量（2.64±0.03）g，從中篩選1 400尾規(guī)格整齊、體質(zhì)健康、無(wú)病無(wú)傷的黃鱔用于試驗(yàn)。

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以魚粉為主要飼料蛋白質(zhì)源，維生素A 醋酸酯為維生素A 添加源，在7組相同基礎(chǔ)飼料上分別添加維生素A 醋酸酯。添加量設(shè)置0～16 000 IU/kg，添加水平分別為：0，500，1 000，2 000，4 000，8 000，16 000 IU/kg（實(shí)測(cè)值：2 910，3 230，3 520，3840，5 020，7 030，11 800 IU/kg，編號(hào)為L(zhǎng)1～L7）。試驗(yàn)所用維生素A醋酸酯（50萬(wàn)IU/kg）購(gòu)買于上海麥克林生化科技有限公司。飼料魚粉、豆粕購(gòu)自江西大佑農(nóng)生物科技有限公司，玉米蛋白粉及雞肉粉購(gòu)自浙江湖州?；噬锟萍加邢薰?。所有飼料原料經(jīng)80 目過篩[30]，按照配比（表1）將各原料充分混勻，加16%的水分后，經(jīng)40 型單螺桿膨化機(jī)在溫度為123～125 ℃下制成粒徑為1.5～2.1 mm 的條狀膨化飼料，避光風(fēng)干后，自封袋密封保存于陰涼干燥處備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地中進(jìn)行，養(yǎng)殖箱為88 cm×66 cm×64 cm 藍(lán)色塑料桶，在養(yǎng)殖箱內(nèi)放置一定數(shù)量的水葫蘆，養(yǎng)殖用水為經(jīng)過曝氣的自來(lái)水。光周期為自然周期，每次喂食記錄水溫，喂食至大部分黃鱔停止攝食為止，并略帶剩余，0.5 h 后觀察并撈出剩料、風(fēng)干計(jì)重。整個(gè)試驗(yàn)期間水溫20.5～28.7 ℃，溶解氧不低于5 mg/L，pH 為6.5～7.4，氨氮濃度不高于2.0 mg/L 和亞硝酸濃度不高于0.10 mg/L。

1.3 樣品采集和相關(guān)計(jì)算

養(yǎng)殖56 d 后停食24 h，對(duì)各養(yǎng)殖箱計(jì)數(shù)及稱重，計(jì)算增重率、特定生長(zhǎng)率（%/d）和飼料系數(shù)，相關(guān)計(jì)算公式如下：

式中：W1、W2分別代表試驗(yàn)黃鱔初均重和末均重（g）；t代表養(yǎng)殖天數(shù)（d）；F代表平均攝食量（g）。

從各箱中隨機(jī)選取4 尾接近均重的黃鱔運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室解剖取樣。準(zhǔn)確稱重、測(cè)量體長(zhǎng)后斷尾采血，采血完成后將黃鱔置于無(wú)菌冰盤上進(jìn)行解剖，取肝臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液，用于制備HE 染色切片。血液于4 ℃環(huán)境靜置24 h，取上清液于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 組織HE切片分析

在光學(xué)顯微鏡（BM2000D江南永新光學(xué)儀器有限公司）下觀察肝臟組織切片，并拍照，使用軟件ScopeImage 9.0 對(duì)切片進(jìn)行標(biāo)注。

1.5 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

飼料營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定采用相同方法；水分含量測(cè)定參考GB/T 6435—2014；粗灰分含量測(cè)定參考GB/T 6438—2007；粗脂肪含量測(cè)定參考GB/T 6433—2006；粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考GB/T 6432—1994；飼料維生素A含量檢測(cè)參照GB/T 17817—2010。

1.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定

嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究試劑盒的說(shuō)明書測(cè)定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性（GPT）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan’s氏多重比較檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05?；貧w折線利用Excel 2019制作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料維生素A水平對(duì)黃鱔生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，飼料維生素A 水平對(duì)黃鱔的末均重（FBW）、增重率（WGR）和特定生長(zhǎng)率（SGR）有顯著影響（P＜0.05），L3組黃鱔的FBW、WGR 和SGR 最高，顯著高于L1組（P＜0.05），與其他組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組飼料系數(shù)（FCR）、存活率（SR）無(wú)顯著差異（P＞0.05）。作折線回歸分析飼料維生素A水平與WGR的關(guān)系（圖1），黃鱔對(duì)飼料維生素A的適宜水平為3 482 IU/kg。

圖1 飼料維生素A水平與黃鱔WGR之間的關(guān)系Fig.1 Relationship between dietary vitamin A levels and WGR of Monopterus albus

表2 飼料維生素A水平對(duì)黃鱔生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of dietary vitamin A levels on growth performance of Monopterus albus（n=4）

2.2 飼料維生素A對(duì)黃鱔形體參數(shù)和臟體指數(shù)的影響

由表3可知，飼料維生素A添加水平對(duì)幼鱔肝體指數(shù)、脾體指數(shù)和肥滿度無(wú)顯著影響（P＞0.05），脾體指數(shù)有先升高后降低的趨勢(shì)。

表3 不同維生素A添加水平對(duì)黃鱔形態(tài)參數(shù)的影響Tab.3 Effects of different vitamin A levels on morphological parameters of Monopterus albus（n=8）

2.3 飼料維生素A對(duì)黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

飼料維生素A 添加水平對(duì)幼鱔血清生化指標(biāo)的影響見表4。隨飼料維生素A 添加水平的升高，血清GOT 和GPT 呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，L7 組血清GOT 最高，L1 組次之，顯著高于L2～L6 組（P＜0.05），L2～L6 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。L7 組血清GPT 顯著高于L1～L5 組（P＜0.05），L6 組次之，顯著高于L2～L4組，且L1～L5組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。血清總T-CHO 和TG含量隨飼料維生素A水平升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，L5組T-CHO 含量顯著高于L1、L6和L7組（P＜0.05），與L2～L4組無(wú)顯著差異（P＞0.05），L3組TG含量最高，L6組次之，L1、L2、L5和L7組最低。

表4 不同維生素A添加水平對(duì)黃鱔血清生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of different vitamin A levels on serum biochemical indexes of Monopterus albus（n=4）

2.4 飼料維生素A對(duì)黃鱔肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

L1 組黃鱔肝細(xì)胞排列沒有規(guī)律，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞核偏移至一側(cè)，部分細(xì)胞核消失，部分肝細(xì)胞破裂。L2～L5 組黃鱔肝臟結(jié)構(gòu)較為完整，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞核明顯且多數(shù)位于細(xì)胞中央。L6、L7 組黃鱔肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞無(wú)核或核偏移數(shù)量多。

圖2 飼料維生素A添加水平對(duì)黃鱔肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of dietary vitamin A levels on liver microstructure of Monopterus albus

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)性能（主要是WGR）是用于評(píng)估適宜維生素A 需求的常見評(píng)價(jià)指標(biāo)，但在某些情況下，也會(huì)使用缺乏或過量攝入的臨床癥狀、最大肝臟儲(chǔ)備水平作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[31]。本試驗(yàn)中，喂食維生素A 水平為2 910 IU/kg 組黃鱔的WGR、SGR顯著低于3 520 IU/kg組，表明飼料維生素A水平低于2 910 IU/kg時(shí)會(huì)影響小規(guī)格黃鱔的生長(zhǎng)速度，以黃鱔WGR 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過折線回歸分析小規(guī)格黃鱔飼料維生素A 的適宜水平為3 482 IU/kg（圖1）。這與青魚幼魚[32]、大口黑鱸（Micropterus salmoides）[33]和花鱸[5]等報(bào)道基本一致，飼料維生素A不足會(huì)導(dǎo)致魚類生長(zhǎng)減緩。

肝臟在維生素A的代謝、攝取、儲(chǔ)存和釋放中起著重要作用[35]。在魚類中，膳食中缺乏維生素A已被證明會(huì)導(dǎo)致魚體肝臟損傷和肝臟體積減小。Taveekijakarn[35]等觀察到大馬哈魚（Oncorhynchus keta）在維生素A 缺乏的飼料中喂養(yǎng)22周后出現(xiàn)肝臟損傷，包括肝板分離和肝細(xì)胞萎縮和壞死。本試驗(yàn)中，L1、L6和L7組肝臟細(xì)胞較其他組肝細(xì)胞偏大，細(xì)胞核消失數(shù)量較多，L6和L7組肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。飼喂缺乏維生素A 飼料的幼建鯉（Cyprinus carpiovarJian）的肝體指數(shù)顯著降低[36]。在日本比目魚中，Hernandez[29]等發(fā)現(xiàn)飼喂不同維生素A 水平魚的肝體指數(shù)沒有顯著差異，但飼喂不添加維生素A 飼料的魚肝體指數(shù)值較低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料維生素A 對(duì)黃鱔肝體指數(shù)、脾體指數(shù)和肥滿度無(wú)顯著影響。一般來(lái)說(shuō)，血清GOT 和GPT 活性可反映肝臟受損程度，這兩種酶通常在暴露于毒素、壓力、疾病或營(yíng)養(yǎng)不良的魚類中作為評(píng)估之一[37]。Hernadez 等[29]等研究了飼料中維生素A 缺少或者過量對(duì)日本比目魚血清GOT 和GPT 活性的影響，以其評(píng)價(jià)比目魚肝臟的損傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和添加25 000 IU/kg 維生素A 試驗(yàn)組比目魚血清中GOT 和GPT 活性顯著高于其他試驗(yàn)組，說(shuō)明飼料中過少或過多的維生素A 都會(huì)對(duì)肝臟造成損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證黃鱔肝臟組織是否受損，試驗(yàn)測(cè)定了黃鱔血清轉(zhuǎn)氨酶活性，其中L1 和L7 組血清轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于L3～L5，說(shuō)明在飼料維生素A 不足或過量，黃鱔肝臟可能受到一定程度損傷。這與吉富羅非魚[15]和花鱸[5]的研究結(jié)果一致。

魚類血清中T-CHO 和TG的含量一定程度上反映了機(jī)體脂質(zhì)代謝情況，T-CHO 和TG都主要在肝臟中合成[38]。本試驗(yàn)中，黃鱔血清T-CHO 和TG 含量隨飼料維生素A 增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。張璐[5]等研究發(fā)現(xiàn)，維生素A 缺乏組（245 IU/kg）花鱸血清T-CHO 和TG 含量顯著低于正常組，且與肝臟脂肪含量的變化情況是一致，推測(cè)維生素A 缺乏時(shí)，花鱸營(yíng)養(yǎng)不良且肝臟可能受到損傷；當(dāng)飼料維生素A 含量達(dá)到15 273 IU/kg時(shí)，血清T-CHO和TG顯著下降，過量的維生素A對(duì)花鱸肝臟造成了一定毒害作用。本試驗(yàn)得到了相似結(jié)果，飼料維生素A含量不足或者過量可能會(huì)影響黃鱔肝臟脂質(zhì)代謝。

以WGR 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，折線分析得出黃鱔對(duì)飼料維生素A 的適宜水平為3 482 IU/kg，綜合生產(chǎn)性能、肝功能和肝臟顯微結(jié)構(gòu)考慮，黃鱔適宜維生素A 水平為3 230～5 020 IU/kg。飼料維生素A 不足（2 910 IU/kg）時(shí)，生長(zhǎng)速度減緩。飼料維生素A 水平過高（7 030 IU/kg）時(shí)，不會(huì)顯著降低生長(zhǎng)速度，但對(duì)肝臟產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。