氣傳性病原菌孢子在作物冠層內(nèi)傳播研究
——以小麥條銹菌夏孢子為例

王?？?，張 洪，高志賢，KALHORO Muhammad Talib，賀新生，康曉慧

（西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

【研究意義】小麥條銹病是典型的多循環(huán)氣傳性真菌病害，病原菌孢子隨氣流傳播是引起臨近區(qū)域寄主發(fā)病的主要原因之一[1]。在越冬區(qū)，條銹病由零星發(fā)病發(fā)展成大小不等的發(fā)病中心是病害流行的必然前提，因此，研究病原菌孢子在小麥冠層中傳播的影響因素，對(duì)于了解氣傳病害的田間傳播規(guī)律和指導(dǎo)制定田間防治策略具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】曾士邁[2]通過分析在小麥條銹病單病葉片條件下臨近植株的發(fā)病情況，對(duì)小麥條銹病的近程傳播進(jìn)行了定量研究，建立了菌量與傳播距離的回歸模型。影響孢子在小麥冠層內(nèi)傳播的因素有：孢子重力沉降、動(dòng)力、湍流的比例和寄主阻擋[3-5]。小麥條銹菌所屬的銹菌目被認(rèn)為是被動(dòng)釋放孢子，需要借助雨滴或者風(fēng)的力量來提供初始動(dòng)力[6-7]。受相對(duì)濕度的影響，小麥條銹菌夏孢子可以單獨(dú)或2～3 個(gè)孢子成團(tuán)傳播[3]。但關(guān)于小麥條銹菌夏孢子的沉降研究尚少見報(bào)道。小麥銹菌在相鄰寄主間的傳播已有了時(shí)空模擬，但是對(duì)于小麥條銹菌在寄主冠層的傳播一直是研究難點(diǎn)[8-10]。Mukherjee 等[11]在小麥葉銹病上通過變速軸流風(fēng)機(jī)模擬發(fā)現(xiàn)，低速風(fēng)與滑落的露珠共同作用可以將大量的真菌孢子傳播到其他小麥上。單菌源條件下，小麥條銹菌夏孢子數(shù)量在小麥冠層內(nèi)隨孢子捕捉高度的增加而減少[12]。劉偉等[13]通過孢子捕捉器發(fā)現(xiàn)小麥白粉病菌孢子捕捉量與據(jù)菌源距離差異顯著，與風(fēng)向呈顯著正相關(guān)。在小麥葉枯病上，具有更短葉長(zhǎng)和葉片更緊湊的小麥往往患病更少[14]。在亞洲大豆銹病上，大豆冠層的葉面積會(huì)影響病原菌孢子的逃逸率[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前，孢子冠層內(nèi)傳播研究仍以模擬研究和田間流行學(xué)調(diào)查為主，對(duì)作物冠層內(nèi)風(fēng)速特征以及植株形態(tài)對(duì)孢子傳播影響的研究少見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于目前對(duì)氣傳性病原菌孢子在作物冠層內(nèi)傳播研究較少，以小麥條銹病為例，通過室內(nèi)模擬和室外測(cè)量相結(jié)合，探究小麥條銹菌夏孢子在作物冠層內(nèi)傳播受到的自身重力、風(fēng)和寄主阻擋的影響，旨在為深入了解小麥條銹病田間傳播梯度規(guī)律和更好地指導(dǎo)氣傳性疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試器材與試驗(yàn)地

供試小麥條銹菌夏孢子于2021 年3 月在四川省綿陽(yáng)市青蓮鎮(zhèn)田間采集，供試小麥品種為川麥104，充當(dāng)菌源小麥品種為明賢169，田間試驗(yàn)在小麥的抽穗揚(yáng)花期時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)所用網(wǎng)篩為280 目篩（孔徑55 μm），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 6003.1—2012，網(wǎng)篩可以篩選出條銹菌單個(gè)夏孢子和少量2～3 個(gè)夏孢子的聚集體。利用生物熒光顯微鏡（MF43）觀察統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。孢子沉降試驗(yàn)在封閉空間內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境溫度為（20±1）℃，相對(duì)濕度（70±3）%。風(fēng)速測(cè)量裝置使用熱敏式風(fēng)速儀AR866（風(fēng)速精度為0.01 m/s）。小麥條銹菌夏孢子田間傳播研究在西南科技大學(xué)校內(nèi)和綿陽(yáng)市青蓮鎮(zhèn)試驗(yàn)基地進(jìn)行。

自制孢子沉降裝置測(cè)量條銹菌夏孢子的沉降速度。豎直固定一根長(zhǎng)1 m 內(nèi)徑2 cm 的亞克力管，管口上方放置網(wǎng)篩，管口下方0.5 cm 處放置平整光滑的紙板。將多個(gè)涂有70%甘油的載玻片依次擺放在紙板上用于收集孢子。亞克力管材質(zhì)中加入抗靜電劑以減少靜電影響。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥條銹菌夏孢子的重力沉降速度測(cè)量 小麥條銹菌夏孢子的重力沉降速度測(cè)量方法參考Ferrandino 等[16]的研究方法；3 種與小麥條銹菌夏孢子大小相近的孢子重力沉降速度為0.86～1.94 cm/s。根據(jù)這一速度范圍進(jìn)行推算，孢子重力沉降經(jīng)過1.005 m 高度的時(shí)間需要51～116 s，再考慮到多個(gè)粘連孢子的重力沉降速度會(huì)更快，用時(shí)更短，因此選用了0～120 s的收集孢子時(shí)間段。

小麥條銹菌夏孢子加入網(wǎng)篩，輕敲一次網(wǎng)篩，使孢子落下。當(dāng)孢子開始落下時(shí)，計(jì)時(shí)，每隔一段時(shí)間緩慢拉動(dòng)紙板，孢子會(huì)受重力影響落入載玻片上，通過顯微鏡收集觀察孢子數(shù)量。收集孢子的時(shí)間段分別是：0～30，30～60，60～90和90～120 s；50～60，60～70，70～80和80～90 s；60～65，65～70，70～75，75～80和75～85 s，試驗(yàn)重復(fù)10 次。根據(jù)孢子收集的時(shí)間段和不同時(shí)間載玻片上孢子數(shù)量，計(jì)算出孢子沉降速度范圍和分布頻率。

亞克力管中受外界氣體流動(dòng)的干擾影響極小，孢子在管中的沉降只受重力和空氣阻力影響。直徑20μm的粒子從靜止到重力與空氣阻力相平衡的弛豫時(shí)間通常在0.001 s[17]，認(rèn)為與之大小接近的小麥條銹菌夏孢子從靜止到速度恒定的時(shí)間會(huì)很短，可以忽略不計(jì)。

1.2.2 小麥冠層垂直梯度和水平梯度上風(fēng)速差異（1）田間小麥冠層垂直梯度梯度上風(fēng)速差異。田間開展相同種植密度下小麥冠層不同高度風(fēng)速差異研究。在長(zhǎng)勢(shì)均勻播種量為150 kg/hm2（本地區(qū)常規(guī)播種量）的小麥田塊中，利用風(fēng)速儀同時(shí)測(cè)量小麥倒一葉、倒二葉和小麥上空10 cm 處（距地面約45，60，80 cm）風(fēng)速。測(cè)量時(shí)間為當(dāng)日14:00—15:00。測(cè)量重復(fù)9次，每次測(cè)量時(shí)間持續(xù)3 min。

（2）不同種植密度下小麥冠層水平梯度梯度上風(fēng)速差異。室內(nèi)開展不同種植密度下小麥冠層內(nèi)風(fēng)速差異研究。有研究表明在風(fēng)速等于或大于1 m/s的情況下條銹菌孢子才可能被釋放[3,18]，本試驗(yàn)研究將在風(fēng)速大于或等于1 m/s的條件下進(jìn)行。室內(nèi)移栽小麥植株，利用變速軸流風(fēng)機(jī)制造恒定風(fēng)向風(fēng)速為1，2，3 m/s 的風(fēng)，在小麥種植密度為20，30，40 萬(wàn)穗/667 m2的下測(cè)量冠層內(nèi)風(fēng)速大小。測(cè)量重復(fù)9 次，每次測(cè)量時(shí)間持續(xù)3 min。

1.2.3 恒定風(fēng)速下阻擋物密度和角度對(duì)小麥條銹菌夏孢子傳播的影響 恒定風(fēng)速下阻擋物密度對(duì)小麥條銹菌夏孢子傳播的影響研究。盡管小麥條銹病主要為害葉片，但是小麥莖稈會(huì)反彈孢子或者粘連孢子[19]，因此本研究模擬了莖稈密度。利用圓柱形玻棒（直徑0.5 cm）模擬20，30，40萬(wàn)/667 m2的莖稈密度，變速軸流風(fēng)機(jī)制造恒定風(fēng)向風(fēng)速為3 m/s（最大風(fēng)速波動(dòng)不超過±0.1 m/s）且湍流強(qiáng)度不超過1%的風(fēng)。在風(fēng)機(jī)前方放置小麥條銹菌夏孢子0.05 g（孔徑55μm 網(wǎng)篩篩后）和圓柱形玻棒（圖1），輕敲一次網(wǎng)篩釋放孢子，玻棒上反向覆蓋透明膠帶收集孢子，試驗(yàn)重復(fù)9次。

恒定風(fēng)速下阻擋物角度對(duì)小麥條銹菌夏孢子傳播的影響研究。利用載玻片（大小為25.4 mm×76.2 mm）模擬兩個(gè)與水平面呈30°、60°夾角梯度形態(tài)的葉片，變速軸流風(fēng)機(jī)制造恒定風(fēng)向風(fēng)速為3 m/s（最大風(fēng)速波動(dòng)不超過±0.1 m/s）且湍流強(qiáng)度不超過1%的風(fēng)。在風(fēng)機(jī)前方放置小麥條銹菌夏孢子0.05 g（孔徑55μm 網(wǎng)篩篩后）和顯微載玻片（圖1），輕敲一次網(wǎng)篩釋放孢子，載玻片上反向覆蓋透明膠帶收集孢子，試驗(yàn)重復(fù)9次。

圖1 孢子傳播裝置Fig.1 The equipment on Spore dispersal

1.2.4 單片病葉下小麥條銹菌夏孢子在小麥冠層內(nèi)的空間分布 試驗(yàn)小區(qū)小麥播種量為150 kg/hm2，行距為20 cm，小區(qū)面積為3 m×4 m=12 m2，保護(hù)行0.5 m，試驗(yàn)在3個(gè)田塊同時(shí)進(jìn)行。將一株自然充分發(fā)病的小麥植株放置于試驗(yàn)小區(qū)中心，小麥植株被剪除其它葉片，只留倒一葉高度的病葉（葉片產(chǎn)孢面積大于90%）。在距地面30，45，60 cm（與倒三葉、倒二葉和倒一葉高度大致相當(dāng)）處水平放置涂有70%甘油的載玻片每日收集孢子。3個(gè)高度的孢子收集裝置是利用長(zhǎng)0.7 m 直徑1.5 cm 的PE管改裝而成，分別距菌源10，50，100，150，200 cm處放置，即收集裝置在同一方向共有5處。在田塊上方1 m處搭建透明塑料薄膜，防止空氣中外來真菌和降雨影響。受薄膜覆蓋帶來的高溫影響，小麥條銹病發(fā)病普遍較輕，本次研究不討論病情數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

載玻片上孢子沉降速度范圍計(jì)算公式為：

式（1）中，v是孢子沉降速度，單位為cm/s；L是亞克力管的長(zhǎng)度，單位為cm；D是載玻片距亞克力管口的距離，單位為cm；t是收集孢子降落時(shí)間，單位為s。

每次重力沉降試驗(yàn)和玻片阻擋試驗(yàn)收集的孢子總量差異較大，因此將孢子總數(shù)歸一化處理，以方便數(shù)據(jù)展示。小麥冠層垂直梯度風(fēng)速差異比較采用鄧肯法；相關(guān)性分析均采用皮爾遜相關(guān)分析法。使用軟件Excel和SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)，通過Origin 2021軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥條銹菌夏孢子的重力沉降速度

小麥條銹菌夏孢子間的大小和重量存在差異[20]，會(huì)導(dǎo)致不同孢子的沉降速度出現(xiàn)差異，從而出現(xiàn)孢子分布差異。選取占比最多的區(qū)間作為小麥條銹菌夏孢子沉降速度。在4 個(gè)時(shí)間梯度范圍為0～30 s、30～60 s、60～90 s 和90～120 s 內(nèi)發(fā)現(xiàn)單個(gè)小麥條銹菌夏孢子的沉降時(shí)間主要分布在60～90 s，占比73.2%（圖2A）。而在時(shí)間梯度范圍為50～60 s、60～70 s、70～80 s和80～90 s中，單個(gè)小麥條銹菌夏孢子的沉降時(shí)間在60～70 s 范圍，占比55.0%（圖2B）。在時(shí)間梯度范圍為60～65 s、65～70 s、70～75 s、75～80 s 和75～85 s中，單個(gè)小麥條銹菌夏孢子的沉降時(shí)間主要分布在65～70 s 區(qū)間，占比52.6%（圖2C）。65～70 s 區(qū)間的沉降速度在1.436～1.546 cm/s范圍。推測(cè)單個(gè)小麥條銹菌夏孢子的沉降速度為（1.491±0.055）cm/s。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)孢子粘連越多，孢子團(tuán)沉降速度越快（圖2D）。

圖2 小麥條銹菌夏孢子沉降時(shí)間分布Fig.2 The sedimentation time distribution of urediniospores of Puccinia striiformis f.sp.tritici

2.2 小麥冠層垂直梯度和水平梯度上風(fēng)速差異比較

風(fēng)速測(cè)量結(jié)果（圖3）表明：小麥冠層倒一葉處平均風(fēng)速與倒二葉處無(wú)顯著差異；小麥冠層上方10 cm處平均風(fēng)速與小麥冠層（倒一葉和倒二葉）存在極顯著差異。在室內(nèi)3種風(fēng)速條件下，小麥種植密度與冠層內(nèi)風(fēng)速均呈極顯著負(fù)相關(guān)，即小麥種植密度越大，冠層內(nèi)風(fēng)速越小（表1）。

表1 不同風(fēng)速條件下冠層風(fēng)速與小麥種植密度的相關(guān)系數(shù)Tab.1 Correlation coefficient between canopy wind speed and wheat planting density under different wind speed conditions

圖3 小麥冠層不同垂直梯度間的風(fēng)速Fig.3 Wind speed between different vertical gradients in wheat canopy

2.3 恒定風(fēng)速下阻擋物密度和角度對(duì)小麥條銹菌夏孢子傳播的影響

模擬研究結(jié)果（圖4）表明：在相同風(fēng)速下，玻棒密度與收集到的小麥條銹菌夏孢子數(shù)呈顯著正相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)為0.588，P＜0.05），即玻棒密度越大收集的孢子數(shù)越多；在相同風(fēng)速下，載玻片角度與收集到的小麥條銹菌夏孢子數(shù)呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)為0.601，P＜0.01），即玻片與地面角度越大收集的孢子數(shù)越多。

圖4 不同阻擋物密度和角度下收集的孢子數(shù)Fig.4 The number of urediniospores collected under different glass rod densities and different glass slide angles

2.4 小麥條銹菌夏孢子田間傳播研究

試驗(yàn)結(jié)果表明：距菌源中心越遠(yuǎn)處孢子捕捉量越少，且距離與孢子捕捉量呈極顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)為-0.424，P＜0.01）；距地面45 cm 處（倒二葉）孢子捕捉量最多，倒三葉處次之，倒一葉處孢子極少；在距菌源中心1.5 m及更遠(yuǎn)的冠層內(nèi)，未能收集到條銹菌夏孢子（圖4、圖5）。

圖5 距菌源不同高度和水平距離下收集的小麥條銹菌夏孢子數(shù)Fig.5 Number of urediniospores of wheat stripe rust collected at different heights and horizontal distances from the source

圖6 田間小麥條銹菌夏孢子空間分布示意圖Fig.6 Spatial distribution of urediniospores of wheat stripe rust in field

3 討論與結(jié)論

從單片病葉或者少量病葉到發(fā)病中心是氣傳性病害流行的關(guān)鍵階段[21-22]。小麥條銹病病原菌主要是以夏孢子的形式進(jìn)行傳播。沉降試驗(yàn)結(jié)果表明單個(gè)小麥條銹菌夏孢子的重力沉降速度范圍為（1.491±0.055）cm/s。在1 m/s 及以上風(fēng)速的定常風(fēng)中和0～1.5 m 的傳播距離下（傳播距離見下文），單個(gè)孢子的重力沉降理論上導(dǎo)致2～3 cm 的垂直位移，對(duì)孢子傳播影響較小。但脈動(dòng)風(fēng)在進(jìn)入小麥田后風(fēng)速會(huì)迅速降低，如在農(nóng)田邊緣測(cè)的1.5 m/s 的平均風(fēng)速，在農(nóng)田中央僅有0.2～0.3 m/s[23]。風(fēng)速在冠層內(nèi)的快速衰減，會(huì)導(dǎo)致相同的距離孢子傳播時(shí)間更長(zhǎng)，受到重力影響的時(shí)間也會(huì)更長(zhǎng)。本次研究中農(nóng)田中間冠層有57.9%的風(fēng)速數(shù)據(jù)是0 m/s，絕大多數(shù)測(cè)量時(shí)間的風(fēng)速小于0.3 m/s；在農(nóng)田同一位置上風(fēng)的持續(xù)時(shí)間在兩三秒至十?dāng)?shù)秒范圍。因此，認(rèn)為小麥條銹菌夏孢子的重力沉降在風(fēng)速較快且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的冠層內(nèi)對(duì)擴(kuò)散影響較小，在風(fēng)速較慢且持續(xù)時(shí)間短的冠層內(nèi)擴(kuò)散影響較大。其次相對(duì)濕度的增加會(huì)導(dǎo)致小麥條銹菌夏孢子成團(tuán)數(shù)量的增加[16]，孢子粘連越多重力沉降速度越大，從而影響孢子冠層內(nèi)傳播距離。

麥田的風(fēng)是復(fù)雜多變的，風(fēng)速主要隨作物生長(zhǎng)密度和據(jù)地面高度而變化[23-25]。曾士邁等[26]認(rèn)為寄主植株密度過密可能會(huì)降低氣流速度，影響孢子傳播。小麥種植密度的加大會(huì)降低風(fēng)速，加快風(fēng)速衰減，田間風(fēng)速測(cè)量結(jié)果也表明遮蔽物更少的冠層上部風(fēng)速更大。間歇性的大風(fēng)是形成氣傳病原菌病害梯度的主要原因[6]。植株垂直梯度上的差異和種植密度的改變會(huì)通過影響風(fēng)速的大小影響孢子的傳播。這里指的風(fēng)速包括了平均風(fēng)速和瞬時(shí)最大風(fēng)速。風(fēng)速與孢子傳播距離具有顯著相關(guān)性的研究報(bào)道較少，這是因?yàn)樯婕暗教镩g試驗(yàn)時(shí)通常會(huì)以平均風(fēng)速來進(jìn)行分析，而進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)應(yīng)該要考慮最大風(fēng)速。

寄主植株形態(tài)和受感染葉片的垂直高度會(huì)影響孢子在作物冠層內(nèi)的擴(kuò)散[15,27-28]。模擬研究結(jié)果表明，阻擋物密度和角度的增加會(huì)顯著增加收集的孢子數(shù)量，說明小麥條銹菌夏孢子的冠層傳播會(huì)受到阻擋物形態(tài)和數(shù)量的影響。在小麥白粉病、水稻稻瘟病等氣傳性病害中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉片形態(tài)會(huì)影響疾病的發(fā)生[29]。在小麥條銹病、水稻稻瘟病等植物病害上，分子抗病機(jī)制研究已取得重要成果[30-31]，但相關(guān)病原菌變異機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，可通過研究作物避病機(jī)制來調(diào)整種植作物冠層形態(tài)（如葉型、葉長(zhǎng)），降低冠層孢子逃逸到空氣中的效率，減少孢子葉面定殖比例，實(shí)現(xiàn)防控氣傳性病害[32]。在孢子實(shí)際傳播中，小麥莖稈和葉片會(huì)隨風(fēng)晃動(dòng)，田間風(fēng)的風(fēng)向風(fēng)速?gòu)?fù)雜多變，本次試驗(yàn)結(jié)果可以為基于孢子傳播防控氣傳病害提供一定借鑒。

孢子在小麥冠層內(nèi)傳播水平距離較近，本試驗(yàn)中孢子傳播未在距菌源1.5 m 及以外發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌孢子，且距離菌源越遠(yuǎn)收集的孢子數(shù)量越少，這與前人研究結(jié)果[12,33]類似。在水平梯度上，收集的孢子主要集中在菌源周邊；在垂直梯度上，收集的孢子主要集中在倒二葉處。臨近10 cm的孢子收集裝置（與菌源無(wú)小麥阻擋）數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)孢子會(huì)向下沉積而不是升高或者水平傳播。這與前人的研究結(jié)論相似，80%的小麥條銹菌夏孢子會(huì)沉積而不是被風(fēng)傳播，其余20%進(jìn)入風(fēng)中傳播[12,34]。不考慮臨近10 cm的孢子收集裝置數(shù)據(jù)，在小麥倒二葉處收集的孢子也總是最多的。推測(cè)認(rèn)為冠層上部（倒二葉處及以上）植株葉片短，空隙更多、風(fēng)速快，小麥條銹菌孢子傳播被阻擋的較少，而冠層下部（倒三葉處）阻礙物較多，氣流流動(dòng)緩慢，孢子傳播受到阻礙較多。

綜上，小麥條銹菌夏孢子冠層內(nèi)傳播距離主要是受風(fēng)、重力和寄主形態(tài)密度等因素綜合作用的結(jié)果。在相同密度和形態(tài)的小麥冠層中，風(fēng)持續(xù)時(shí)間越久風(fēng)速越快，孢子容易傳播的更遠(yuǎn)，受重力沉降影響更小，反之，則受重力沉降影響更大。更密集的小麥會(huì)降低風(fēng)速，影響孢子傳播；葉片角度會(huì)影響孢子的附著效率。通過分析田間風(fēng)的特征，討論孢子重力沉降速度和阻擋物數(shù)量形態(tài)對(duì)孢子傳播的影響，探討了冠層內(nèi)小麥條銹菌夏孢子傳播的影響因素以及如何有效地利用寄主冠層形態(tài)達(dá)到農(nóng)業(yè)防治植物病害的目的，但是關(guān)于寄主阻擋和冠層內(nèi)風(fēng)的研究有待進(jìn)一步開展。