LLNA∶BrdU-ELISA法與BT法檢測(cè)5種農(nóng)藥 致敏性的對(duì)比研究

熊莉娟，賈 菠，劉 歡，周銀平，萬筱榮，劉永泉

(1.江西省職業(yè)病防治研究院，南昌 330006；2.江西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

高效、低毒一直是國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥發(fā)展的目標(biāo)，但由于各種因素的影響，農(nóng)藥在保障農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)也會(huì)給人類健康帶來一定的損害[1]。我國(guó)農(nóng)藥依據(jù)《農(nóng)藥登記管理辦法》實(shí)行登記管理，農(nóng)藥登記必須提交農(nóng)藥的毒理學(xué)試驗(yàn)報(bào)告。為農(nóng)藥登記而進(jìn)行的毒理學(xué)試驗(yàn)在國(guó)標(biāo)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》中共分為28部分，其中皮膚變態(tài)反應(yīng)(致敏)試驗(yàn)為第9部分。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的目的是檢測(cè)農(nóng)藥是否會(huì)引起人產(chǎn)生瘙癢等免疫源性皮膚反應(yīng)[2]。評(píng)估農(nóng)藥皮膚致敏性的方法在國(guó)標(biāo)中推薦的是局部封閉涂皮試驗(yàn)(BT)、豚鼠最大值試驗(yàn)(GMPT)和小鼠局部淋巴結(jié)分析試驗(yàn)(LLNA)。BT法和GPMT法的不足是使用動(dòng)物數(shù)量多，試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果依靠主觀判定。LLNA法使用動(dòng)物數(shù)量減少，小鼠替代豚鼠，試驗(yàn)時(shí)間縮短，結(jié)果更加客觀，但存在放射安全和環(huán)境污染等問題，為推廣應(yīng)用帶來困難[3]。LLNA∶BrdU-ELISA法是在細(xì)胞增生過程中將溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)摻入細(xì)胞DNA中，用ELISA方法測(cè)定淋巴細(xì)胞中BrdU的量[4]。LLNA∶BrdU-ELISA法解決了放射性物質(zhì)的污染問題，且試驗(yàn)周期短，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高[5]，已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)化妝品、化學(xué)品等各種試驗(yàn)[6-9]，但在農(nóng)藥檢測(cè)方面未見系統(tǒng)的比較研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在對(duì)比LLNA∶BrdU-ELISA法和經(jīng)典的封閉涂皮試驗(yàn)對(duì)受試物致敏性判斷的能力，以探討該方法替代封閉涂皮試驗(yàn)用于農(nóng)藥致敏性檢測(cè)的可行性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

8~10周齡的Balb/c小鼠，雌性，SPF級(jí)，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘) 2019-0004。體重250~300 g的Hartley豚鼠，普通級(jí)，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘) 2019-0015。小鼠和豚鼠分別飼養(yǎng)于江西省職業(yè)病防治研究院屏障系統(tǒng)動(dòng)物房和普通動(dòng)物房，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(贛) 2018-0006，溫度20~ 25 ℃，濕度52 %~60 %。動(dòng)物試驗(yàn)通過試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 受試物

2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上?；瘜W(xué)三廠)，用丙酮/橄欖油AOO (sigma，Torres Y Ribelles S.A.)(體積比4∶1)配制成0.1% (質(zhì)量體積比)濃度；己基肉桂醛(HCA)用AOO配制成25% (體積比)濃度，異丙醇、水楊酸甲酯和乳酸均用AOO配制成50% (體積比)濃度，以上4種化學(xué)物均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。5種農(nóng)藥為農(nóng)藥生產(chǎn)單位送檢樣品，標(biāo)識(shí)齊全，分別為：5%阿維菌素乳油(青島正道藥業(yè)有限公司)、450 g/L咪鮮胺水乳劑(青島金正農(nóng)藥有限公司)、40%噁草酮懸浮劑(青島瀚生生物科技股份有限公司)、1.2%辛菌胺水劑(濟(jì)南賽普實(shí)業(yè)有限公司)和250 g/L吡唑醚菌酯乳油(福建省德盛生物工程有限責(zé)任公司)。

1.3 主要儀器和試劑

AR224CN分析天平[奧康斯儀器(常州)有限公司]；ELX800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；R550IE多通道動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；游標(biāo)卡尺、細(xì)胞篩網(wǎng)、PBS液(北京索萊寶公司)；BrdU粉劑、BrdU-ELISA試劑盒(Roche公司)。

1.4 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法

動(dòng)物飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分組(4只/組)，設(shè)受試物組、AOO組和蒸餾水組。在試驗(yàn)第1、2、3 d在小鼠雙耳背部分別涂抹受試物、AOO溶液和蒸餾水25 μL，涂抹前用游標(biāo)卡尺測(cè)量耳厚度。試驗(yàn)第5 d每只小鼠腹腔注射BrdU標(biāo)記液0.5 mL；注射后24 h采用七氟烷麻醉處死小鼠，測(cè)量耳厚度，取雙側(cè)耳后淋巴結(jié)稱重后用玻璃勻漿器研磨。200目過篩后用PBS液重懸，將每只小鼠的淋巴細(xì)胞懸液定容至15 mL。

將100 μL淋巴細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每只小鼠3個(gè)平行孔，1 200 r/min離心10 min。經(jīng)試劑盒處理后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值(發(fā)射波長(zhǎng)和 參考波長(zhǎng)分別為370 nm、492 nm)。

BrdU標(biāo)記指數(shù)=(As370-Ak370)-(As492-Ak492) 式中：As370為受試物組在370 nm波長(zhǎng)的吸光度；As492為受試物組在492 nm波長(zhǎng)的吸光度；Ak370為空白組在370 nm波長(zhǎng)的吸光度；Ak492為空白組在492 nm波長(zhǎng)的吸光度。

按照下列公式計(jì)算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)，SI＜1.6為致敏陰性，SI≥1.6為致敏陽(yáng)性。

1.5 豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)方法

豚鼠試驗(yàn)分為10組，每組13只。2,4-二硝基氯苯組的誘導(dǎo)濃度為1.0%，激發(fā)濃度為0.5%；25%己基肉桂醛組的誘導(dǎo)濃度為25%，激發(fā)濃度為12.5%；乳酸、異丙醇和水楊酸甲酯的誘導(dǎo)濃度均為50%，激發(fā)濃度均為25%；1.2%辛菌胺水劑、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鮮胺水乳劑、40%噁草酮懸浮劑以及5%阿維菌素乳油的誘導(dǎo)濃度為原樣0.1 mL，激發(fā)濃度依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果定為原樣1∶1蒸餾水稀釋液0.1 mL，為不引起皮膚刺激的最高劑量；陰性對(duì)照組僅給予激發(fā)試驗(yàn)。

依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 15670.9—2017進(jìn)行局部封閉涂皮試驗(yàn)，觀察并記錄激發(fā)接觸后24 h、48 h和12 d的皮膚反應(yīng)。按照局部封閉涂皮法的皮膚反應(yīng)評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分，將試驗(yàn)組出現(xiàn)皮膚紅斑或水腫(不論程度輕重)的動(dòng)物數(shù)減陰性對(duì)照組出現(xiàn)皮膚紅斑或水腫(不論程度輕重)的動(dòng)物數(shù)所得的差除以動(dòng)物總數(shù)，計(jì)算每組動(dòng)物的致敏率并判定受試物的致敏強(qiáng)度。

1.6 LLNA∶BrdU-ELISA結(jié)果與傳統(tǒng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較

將5種化學(xué)物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性檢測(cè)結(jié)果與豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果及LLNA∶BrdU-ELISA法CBA小鼠文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

用SPSS 25.0對(duì)LLNA∶BrdU-ELISA法的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVE)對(duì)耳厚差、淋巴結(jié)濕質(zhì)量和BrdU標(biāo)記指數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步用Dunnett’s T3檢驗(yàn)法對(duì)受試組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法的試驗(yàn)結(jié)果

0.1% 2,4-二硝基氯苯和25%己基肉桂醛的淋巴結(jié)濕質(zhì)量以及BrdU標(biāo)記指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛、50%乳酸、5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和50%乳酸的SI均大于1.6。結(jié)果見表1。

表1 5種化學(xué)物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1

2.2 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較

相關(guān)文獻(xiàn)中[10]異丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法與BT法均為致敏陰性，與本研究結(jié)果一致，但文獻(xiàn)中異丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法存在致敏假陽(yáng)性結(jié)果。乳酸BT法試驗(yàn)結(jié)果為致敏陰性，而LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法小鼠結(jié)果[10]均有假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生。其他化學(xué)物和農(nóng)藥的LLNA∶BrdU- ELISA (BALB/c)法與BT法結(jié)果均一致。結(jié)果見表2。

表2 5種化學(xué)物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法與BT法致敏性檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的比較

3 討 論

OECD指南TG442B推薦CBA小鼠，但該品系小鼠在國(guó)內(nèi)使用量較少，繁殖周期較長(zhǎng)，價(jià)格較高，不易推廣應(yīng)用；國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者進(jìn)行了研究證實(shí)BALB/c小鼠是替代CBA小鼠的較好選擇，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，遺傳背景明確穩(wěn)定[11-14]。本研究選取了5種化學(xué)物和5種農(nóng)藥，采用LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法對(duì)其致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在本試驗(yàn)條件下，LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法中0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和乳酸為致敏陽(yáng)性，異丙醇、水楊酸甲酯、5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鮮胺水乳劑和40%噁草酮懸浮劑為致敏陰性。就“是或否”具有致敏性的判斷來說，90% (9/10)的受試物判斷結(jié)果一致，可以認(rèn)為L(zhǎng)LNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和BT法對(duì)農(nóng)藥致敏性判斷能力沒有差異。由于受試物數(shù)量有限，故只能保守地認(rèn)為L(zhǎng)LNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判斷農(nóng)藥致敏性的潛能，是否可行還需要進(jìn)行更大樣本量的驗(yàn)證。

由于刺激物和致敏物均可對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖作用，會(huì)致使LLNA產(chǎn)生假陽(yáng)性[15]，OECD指導(dǎo)原則TG442B中規(guī)定試驗(yàn)要觀察給藥動(dòng)物的耳部紅斑和耳厚度，一旦給藥組動(dòng)物耳厚度較對(duì)照組增加到25%以上，或紅斑評(píng)分≥3，應(yīng)下調(diào)給藥濃度[16]。目前有研究通過增選刺激性指標(biāo)(耳廓質(zhì)量、耳厚差)對(duì)化學(xué)物的刺激性和致敏性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)[17-18]。本研究中通過耳厚差評(píng)價(jià)受試物的刺激性，5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑和250g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。查閱本研究室相關(guān)急性皮膚刺激試驗(yàn)記錄：5%阿維菌素乳油的刺激強(qiáng)度為中等刺激性，1.2%辛菌胺水劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的刺激強(qiáng)度為輕度刺激性，表明耳厚差能對(duì)農(nóng)藥的急性皮膚刺激性進(jìn)行初步判定。

農(nóng)藥可分為單劑和混劑，根據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)截至2022年6月13日)，在登記有效期內(nèi)的農(nóng)藥單劑數(shù)占總登記農(nóng)藥數(shù)的69%。本研究結(jié)果表明LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判斷農(nóng)藥單劑的致敏性的潛能，但其能否運(yùn)用于判斷農(nóng)藥混劑的致敏性還需進(jìn)一步研究。