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    大噪鹛多組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝和基因注釋

    2022-10-08 03:16:48李仁明秀劉乙蘭月耿煬楊楠岳碧松
    四川動(dòng)物 2022年5期
    關(guān)鍵詞:肺臟測(cè)序通路

    李仁明秀,劉乙,蘭月,耿煬,楊楠,岳碧松*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065;2.四川省生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院,成都 610041;3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院,成都 610041)

    大噪鹛隸屬于雀形目Passeriformes噪鹛科Leiothrichdae噪鹛屬,為該科體型最大的物種之一(Cheng,1987;Rasmussen&Anderton,2005),主要分布在四川、重慶、湖北、甘肅南部、西藏東南部以及云南西北部,我國(guó)特有種(鄭光美,2017),國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物(國(guó)家林業(yè)和草原局,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部,2021),其垂直分布范圍跨度較大(海拔2 135~4 115 m),甚至在海拔4 200 m以上地區(qū)也能生存(張強(qiáng)等,2010),棲息環(huán)境主要包括亞高山、高山深林灌叢及其周圍的林緣地帶(del Hoyo,2007)。

    隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析技術(shù)研究基因的表達(dá)調(diào)控的差異越來(lái)越廣泛(Bai,2016;Zhang,2016;Wang,2017;Zhao,2018)。目前通過(guò)高通量測(cè)序分析,對(duì)于高海拔低氧環(huán)境的綠尾紅雉(Qu,2013)、藏豬(Ai,2014)、褐 背 擬 地 鴉(Wang,2015)、藏雞(Cui,2019)等已有相關(guān)適應(yīng)性的研究。大噪鹛分子遺傳信息匱乏,目前僅有關(guān)于甘肅蓮花山大噪鹛的繁殖習(xí)性研究(Wang,2010)。本研究通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)采自四川省甘孜藏族自治州帕姆嶺和察青松多白唇鹿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的8只大噪鹛的39個(gè)組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過(guò)組裝、注釋,獲得了第一個(gè)組裝質(zhì)量較高的大噪鹛轉(zhuǎn)錄組,為進(jìn)一步研究其遺傳學(xué)和瀕危機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),通過(guò)不同組織間的差異表達(dá)分析大噪鹛高海拔生存適應(yīng)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    大噪鹛樣品共8只(均為多年鳥類監(jiān)測(cè)過(guò)程中,撞網(wǎng)受傷而無(wú)法救治的個(gè)體):5只采自四川省甘孜藏族自治州雅江縣八角樓鄉(xiāng)帕姆嶺(101°18′E,30°10′N,海拔4 147 m),編號(hào)分別為PA、PB、PC、PD、PE,取心臟、肝臟、胃、肺臟、腎臟和肌肉6種組織,編號(hào)分別為1~6;3只采自四川省甘孜藏族自治州白玉縣察青松多白唇鹿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(99°20′E,30°59′N,海拔3 800 m),編號(hào)分別為CA、CB、CC,取心臟、肺臟、肌肉3種組織,編號(hào)分別為1~3;共計(jì)39個(gè)組織樣本,液氮保存。由于察青松多采集的心臟與肺臟組織樣本未明確標(biāo)記,為避免混淆,組裝過(guò)程采用39個(gè)組織樣本以獲得更完整的轉(zhuǎn)錄本,后續(xù)分析過(guò)程中僅采用帕姆嶺地區(qū)的組織樣本。

    1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

    使 用Invitrogen的TRIzol試 劑 盒(Promega,USA)進(jìn)行總RNA提取,操作流程按照說(shuō)明書進(jìn)行,提取后交付北京諾禾致源科技股份有限公司建庫(kù),并在Illumina Hiseq2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序,測(cè)序片段長(zhǎng)約200 bp。

    1.3 轉(zhuǎn)錄組組裝

    在Trinity 2.4.0(Grabherr,2011)中 以把39個(gè)組織合并組裝成共同的無(wú)參轉(zhuǎn)錄本(Geng,2017),只保留片段長(zhǎng)度在300 bp以上的contig序列(Haas,2013)。組裝參數(shù):Trinitymax_memory 200G-CPU 80-min_contig_length 300。組裝完成后再通過(guò)EvidentialGene的tr2aacds(http://arthropods.eugenes.org/EvidentialGene/about/EvidentialGene_trassembly_pipe.html)去 除 片 段 化的、低編碼潛力的以及序列高度相似的轉(zhuǎn)錄本。組裝完成后,選取最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。

    1.4 功能注釋

    使用BLAST(Altschul,2012)將組裝完成的轉(zhuǎn)錄本與Swiss-prot、Pfam、EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),E值設(shè)置為1E-5。將Swiss-port數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果導(dǎo)入Blast2GO(Conesa,2005)進(jìn)行GO注釋,通過(guò)WEGO 2.0(Ye,2018)進(jìn)行可視化展示。以真核生物為背景基因集,使用KEGG Automatic Annotation Server(KAAS)(Yuki,2007)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KEGG通路分析。

    1.5 基因差異表達(dá)分析

    通過(guò)Salmon(Patro,2017)計(jì)算轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量得到每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads,TPM),對(duì)帕姆嶺的30個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)性對(duì)比和主成分分析,通過(guò)Trinity的EdgeR包(Smyth,2010)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log(fold change)|≥2且<0.05。使用ClusterProfile(Yu,2012)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

    2 結(jié)果

    2.1 測(cè)序結(jié)果

    共得到原始reads 914 244 993條(約274 Gb),過(guò)濾后得到的高質(zhì)量reads共896 246 793條(約269 Gb),有效reads的比例高于96.3%,質(zhì)量在Q20以上的reads超過(guò)95%,質(zhì)量在Q30以上的reads超過(guò)88%(表1)。證明本次大噪鹛轉(zhuǎn)錄組樣品測(cè)序質(zhì)量與過(guò)濾結(jié)果較好,可用于后續(xù)分析。

    表1 各樣品測(cè)序結(jié)果匯總Table 1 Summary of sequencing results of each sample

    2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

    通過(guò)Trinity拼接組裝共獲得848 451條轉(zhuǎn)錄本(表2),拼接的總長(zhǎng)度為1 165 234 924 bp,平均長(zhǎng)度為1 373.37 bp,N50為4 474 bp。通過(guò)tr2aacds去除冗余片段后,共獲得308 343條轉(zhuǎn)錄本,總長(zhǎng)度為406 642 215 bp,平均長(zhǎng)度為1 318.80 bp,N50為2 748 bp。

    表2 大噪鹛的轉(zhuǎn)錄組組裝Table 2 Transcriptome assembly of Garrulax maximus

    2.3 轉(zhuǎn)錄本注釋

    將組裝好的轉(zhuǎn)錄本與5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)和功能注釋,共獲得有注釋信息的83 379條轉(zhuǎn)錄本:Swiss-port數(shù)據(jù)庫(kù)75 138條、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)59 118條、GO數(shù) 據(jù) 庫(kù)66 742條、Pfam數(shù) 據(jù) 庫(kù)39 738條、EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)55 604條。同時(shí)在5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋信息的轉(zhuǎn)錄本共31 019條(圖1)。

    圖1 大噪鹛轉(zhuǎn)錄本功能注釋Fig.1 Function annotation of Garrulax maximus transcripts

    按照細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)傳遞、信息儲(chǔ)存與處理、新陳代謝以及無(wú)特征基因?qū)⒆⑨尩降霓D(zhuǎn)錄本分為4大類25小類:無(wú)顯著特征的轉(zhuǎn)錄本15 830條(46.9%),其次為信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制(8 373條)、翻譯后修飾轉(zhuǎn)運(yùn)(5 911條)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸(3 590條)(圖2)。

    圖2 大噪鹛轉(zhuǎn)錄本的EggNOG功能分類Fig.2 EggNOG analysis of Garrulax maximus transcripts

    將轉(zhuǎn)錄本分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能,其中,細(xì)胞組分中注釋到的轉(zhuǎn)錄本最多,共60 651條,占90.8%;生物學(xué)過(guò)程中注釋到的轉(zhuǎn)錄本最少,只有1 380條,占2.1%(圖3)。

    圖3 大噪鹛轉(zhuǎn)錄本的GO功能分類Fig.3 GO analysis of Garrulax maximus transcripts

    注釋到轉(zhuǎn)錄本最多的前5條通路分別為:碳水化合物代謝(ko01200)、核糖體(ko03010)、氨基酸生物合成(ko01230)、嘌 呤 代 謝(ko00230)和 癌 癥 通 路(ko05200),分別注釋到1 345條、1 268條、1 103條、1 045條和1 004條。

    2.4 樣本重復(fù)性分析

    帕姆嶺樣本中,PC4、PC6和PE6為離群樣本,剔除后構(gòu)建相關(guān)性矩陣,可分為6組,依次為心臟、肌肉、胃、肝臟、腎臟和肺臟,各組的樣本重復(fù)性均較好。

    主成分分析結(jié)果顯示,27個(gè)組織樣本可被清楚分為5個(gè)聚類簇,其中,心臟、肌肉和胃有一定的重疊,彼此顯示出較近的聚類關(guān)系;其余3種組織分別聚類在不同方位(圖4)。

    圖4 帕姆嶺地區(qū)大噪鹛6種組織樣本主成分分析結(jié)果Fig.4 Principle component analysis of 6 tissue samples from Garrulax maximus in Pamuling area

    2.5 差異表達(dá)基因分析

    共得到36 059個(gè)差異表達(dá)基因(表3):肺臟與肝臟的差異表達(dá)基因數(shù)量最多(12 442個(gè)),肌肉與心臟的最少(4 005個(gè))。

    表3 大噪鹛6種組織間差異表達(dá)基因數(shù)Table 3 Number of differentially expressed genes among 6 tissues of Garrulax maximus

    心臟的差異表達(dá)基因共富集在228條GO條目上,主要是與心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育相關(guān)的條目,如心房肌細(xì)胞發(fā)育(GO:0055014)、心肌組織形態(tài)發(fā)生(GO:0055008)、胚胎心管形態(tài)發(fā)生(GO:0003143)、房間隔形態(tài)發(fā)生(GO:0060413)及心肌纖維發(fā)育(GO:0048739)等;還顯著富集到心臟收縮調(diào)節(jié)的相關(guān)條目,如心肌收縮(GO:0060048)、肌肉收縮(GO:0006936)、肌肉收縮調(diào)節(jié)(GO:0006937)及通過(guò)調(diào)節(jié)游離鈣離子的釋放來(lái)調(diào)節(jié)心肌收縮(GO:0010881)等;此外,還富集到呼吸鏈上能量傳遞的許多通路,如呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(GO:0045277)、氧化磷酸化(GO:0006119)、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ(GO:0005747)等。心臟一共富集到了18條KEGG通路,除了心臟收縮功能相關(guān)的通路,還富集到了與體液滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的腎素分泌(ko04924)、醛固酮合成與分泌(ko04925),并且心鈉肽差異表達(dá)基因(natriuretic peptide precursor A,NPPA)富集在心臟的多條通路上。

    肺臟一共富集到了43條GO條目,其中有21條富集結(jié)果與免疫反應(yīng)相關(guān),如:?jiǎn)魏思?xì)胞趨化性(GO:0002548)、抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答(GO:0061844)、淋 巴 細(xì) 胞 趨 化 性(GO:0048247)、趨化因子活性(GO:0008009)、炎癥反應(yīng)(GO:0006954)、炎 癥 反 應(yīng) 的 正 調(diào) 控(GO:0050729)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0070098)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0019221)、整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附負(fù)調(diào)控(GO:0033629)、巨噬細(xì)胞趨化性(GO:0048246)、中性粒細(xì)胞趨化性(GO:0030593)、中性粒細(xì)胞活化(GO:0042119)、脂多糖結(jié)合(GO:0001530)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)(GO:0071222)和細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-1的反應(yīng)(GO:0071347)等。此外,還富集到與氧氣運(yùn)輸、血管生成、造血相關(guān)的通路。肺臟富集到了21條KEGG通路,其中大部分也是免疫與疾病相關(guān)的通路,包括Toll樣受體信號(hào)通路(ko04620)、趨化 因 子 信 號(hào) 通 路(ko04062)、IL-17信 號(hào) 通 路(ko04657)、JAK-STAT信號(hào)通路(ko04630)等。差異表達(dá)基因IL8、NFKB1、IL3RB等被富集在KEGG通路中。

    肝臟一共富集到了298條GO條目和44條KEGG通路。GO富集結(jié)果分為以下三大類,一是維生素A代謝相關(guān)通路,如對(duì)維生素A的反應(yīng)(GO:0033189)、視 黃 醇 代 謝 過(guò) 程(GO:0042572)和維甲酸代謝過(guò)程(GO:0042573)等;二是脂類代謝的相關(guān)通路,如脂肪酸結(jié)合(GO:0005504)、高 密 度 脂 蛋 白 顆 粒(GO:0034364)、膽固醇代謝過(guò)程(GO:0008203)等;三是發(fā)揮解毒功能的相關(guān)通路,如有毒物質(zhì)結(jié)合(GO:0015643)、藥物結(jié)合(GO:0008144)、細(xì)胞葡萄糖醛酸化(GO:0052695)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)(GO:1904224)等。KEGG富集結(jié)果主要也是與物質(zhì)合成代謝相關(guān)的通路,以及解毒功能相關(guān)的細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝(ko00980)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450(ko00982)。

    3 討論

    本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)首次對(duì)8只大噪鹛的肝臟、心臟、肌肉、胃、肺臟以及腎臟等6個(gè)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝以及功能注釋。在差異表達(dá)基因的功能富集結(jié)果中,肺臟組織中富集到大量與免疫相關(guān)的Toll樣受體,Toll樣受體可以識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的肽多糖、革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖以及病毒的遺傳物質(zhì)雙鏈RNA等相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)序列(Aderem & Ulevitch,2000),屬于機(jī)體的固有免疫(Akira & Takeda,2004),可以快速激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的一系列催化蛋白及信號(hào)因子,使機(jī)體快速產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子等,從而調(diào)控免疫細(xì)胞的功能并清除病原體。由此說(shuō)明了長(zhǎng)期生活在高海拔地區(qū)的大噪鹛可能通過(guò)增強(qiáng)先天免疫以抵御呼吸過(guò)程中外界病原體的侵襲。

    長(zhǎng)期生活在高海拔地區(qū),體內(nèi)血液的分布也會(huì)發(fā)生變化,心血管系統(tǒng)的血流分布會(huì)相對(duì)增多,而腎臟的血流會(huì)相對(duì)減少,刺激腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Hurtado-Arestegui,2018),導(dǎo)致血壓升高。大噪鹛心臟組織中發(fā)現(xiàn)了腎素分泌、醛固酮合成與分泌通路,并發(fā)現(xiàn)NPPA富集在多條通路上。NPPA基因編碼心鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)的前體,在高血容量以及高血壓情況下,心肌細(xì)胞釋放ANP到血液循環(huán)中,ANP的主要作用是促進(jìn)腎臟利鈉利尿,放松血管平滑肌,從而調(diào)節(jié)血容量和血壓(Song,2015)。此外,ANP還能抑制醛固酮的產(chǎn)生(Maack,1984)。大噪鹛通過(guò)腎素、醛固酮相關(guān)通路以及ANP協(xié)同調(diào)節(jié)血壓,減少低氧刺激導(dǎo)致的功能紊亂的影響,這可能也是大噪鹛在高海拔生存時(shí)的機(jī)體優(yōu)化策略之一。

    在肝臟的差異表達(dá)分析中,篩選到了大量上調(diào)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因。GST是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族的成員,主要在清除自由基系列反應(yīng)的前期催化氧自由基與谷胱甘肽結(jié)合(Hayes,2005)。氧自由基不及時(shí)清除會(huì)引起細(xì)胞破壞、蛋白質(zhì)破壞、DNA破壞,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。長(zhǎng)期的高原生活還可能因?yàn)槁匀毖醵鹑毖跣愿渭?xì)胞損傷,其臨床病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹和脂肪變性(萬(wàn)平新等,2016)。缺氧情況下機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧(Dawson,1993)。因此,雖然氧化應(yīng)激反應(yīng)在低氧環(huán)境下難以避免,大噪鹛肝臟組織通過(guò)上調(diào)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族的相關(guān)基因,可以盡可能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)所帶來(lái)的傷害。

    綜上所述,本研究基于大噪鹛心臟、肝臟、胃、肺臟、腎臟、肌肉6種組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量的差異,對(duì)各個(gè)組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟、肝臟、肺臟3種組織中有許多組織特異性的差異表達(dá)基因,并且表達(dá)量差異顯著,表明這些組織在大噪鹛低氧習(xí)服的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但受限于保護(hù)物種,本次研究的樣品數(shù)量較少,后續(xù)還可以進(jìn)行多地非損傷性采樣,為大噪鹛的保護(hù)提供更多的線索與數(shù)據(jù)。

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