響應(yīng)面法優(yōu)化聚酰胺層析純化煙草綠原酸的工藝研究

陳月星，李亞文，張梅娟

(商洛學(xué)院，陜西 商洛 726000)

煙草種植與加工在我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1-2]，基于廢次煙草的循環(huán)利用和綠原酸產(chǎn)業(yè)需求，擬采用響應(yīng)面法，對(duì)煙草綠原酸純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

廢次煙葉(商洛市煙草公司提供)。

1.2 試劑

95%乙醇、乙酸、氫氧化鈉、纖維素酶(食品級(jí))、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、無(wú)水甲醇、聚酰胺樹(shù)脂。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平(BS110)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A)、恒溫水浴鍋(HH-4)、微型粉碎機(jī)(FW80)、pH 計(jì)(PHS-3C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52-99)、真空抽濾機(jī)(CM- 2002)、高效液相色譜儀(TDP-009)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

參照李亞男等[3]的方法進(jìn)行綠原酸粗品提取。

1.4.2 聚酰胺層析法對(duì)煙草綠原酸純化工藝流程

取100 mL綠原酸粗品傾入裝有預(yù)處理好的聚酰胺樹(shù)脂層析柱→乙醇洗脫→真空干燥得到綠原酸純品→聚酰胺回收再生。

1.4.3 高效液相色譜法測(cè)定綠原酸方法的建立

樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的綠原酸粗品置入25 mL容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解定容至刻度，充分混合后經(jīng)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

色譜條件。HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為0.5%的乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，柱溫為35℃，柱流量為1 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，梯度洗脫為0～10 min A90%、B10%，10～15 min A59%、B41%，15～20 min A90%、B10%，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。色譜柱型號(hào)及參數(shù)為ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。精確稱(chēng)取10 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于25 mL容量瓶用甲醇定容到刻度。用高效液相色譜儀檢測(cè)稀釋液峰面積，以綠原酸的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，以此來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 聚酰胺柱層析法純化綠原酸單因素實(shí)驗(yàn)

聚酰胺柱層析基準(zhǔn)工藝：用30 mL濃度為8 mg/mL的吸附液上80～100目聚酰胺柱(16×300 mm)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用2.5 BV 45%的乙醇來(lái)進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，測(cè)定不同洗脫液濃度中的綠原酸含量，計(jì)算解吸附率。

在以上工藝基礎(chǔ)上，對(duì)上柱液濃度、洗脫液濃度和用量(BV)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，因素及水平如表1所示。

表1 單因素及其水平表Tab.1 Single factors and their levels

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件、Box-Behnken法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得聚酰胺層析法純化煙草綠原酸的最優(yōu)工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，回歸方程為y=154.99x-2.329 8，R2=0.999 9，表明綠原酸在0.2～1 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

經(jīng)分析，各因素最佳水平分別為：上柱液濃度為8 mg/mL、洗脫液濃度60%和洗脫液體積2.5 BV，因此確定上樣液濃度6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，洗脫液濃度50%、60%和70%，洗脫液體積1.5 BV、2.5 BV和3.5 BV進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，其中A0B0C0組合解析率最高為92.97%。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken test protocol and results

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型分析

建立以上柱液濃度X1、洗脫液濃度X2、洗脫液體積X3為自變量，解吸附率 Y為因變量的回歸模型，回歸方程

Y=91.55+1.48X1+1.68X2+2.3X3+0.78X1X2+2.02X1X3-2.59X2X3-10.2X12-8.38X22-5.79X32

由表3可以得到，F(xiàn)值為61.2，P值<0.000 1的模型，表明該模型具有高度的顯著性。決定系數(shù)R2=0.994 3，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值吻合度極高，可以解釋99.43%的響應(yīng)值變化，R2=0.997 5有合理的一致性，失擬相P值0.736 2>0.05，不顯著，說(shuō)明該二次方程與真實(shí)響應(yīng)面擬合度較高，模型成立?；貧w模型中C、BC、A2、B2、C2都達(dá)到影響極顯著(P<0.01)，A、B、AC影響顯著(P<0.05)，說(shuō)明各個(gè)影響因素對(duì)解吸附率具有顯著的影響。變異系數(shù)C.V%值為1.61，比較穩(wěn)定。說(shuō)明可以使用該模型對(duì)煙草綠原酸的純化工藝優(yōu)化做出合理的分析和評(píng)估。

表3 回歸模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 Statistical results of regression model

各個(gè)單因素對(duì)解吸附率的影響從大到小依次為C(洗脫液用量)>B(洗脫液濃度)>A(上柱液濃度值)，AB交互作用不顯著，AC、BC交互作用分別達(dá)到顯著和極顯著水平。

2.3.3 工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面模型的分析，得到最佳純化工藝參數(shù)為上柱液濃度為8.13 mg/mL，洗脫液濃度為61.49%的乙醇，用量為2.71 BV。此條件下，解吸附率為91.52%。

2.3.4 最佳工藝參數(shù)結(jié)果驗(yàn)證

因響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得到的綠原酸解吸附率為91.52%，低于響應(yīng)面試驗(yàn)組合A0B0C0，故以響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果工藝(W1)、A0B0C0工藝(W2)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為了方便實(shí)驗(yàn)，將響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果整合為上柱液濃度為8.1 mg/mL，洗脫液濃度為61%，用量為2.7 BV，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.4 Analysis of confirmatory experiment results

由表4可知，W1比W2平均解吸附率較高，因此最佳純化工藝參數(shù)為上柱液濃度8.1 mg/mL，洗脫液濃度61%，用量2.7 BV。

3 結(jié)論與討論

以廢次的煙葉為研究對(duì)象，采用聚酰胺柱層析法對(duì)煙草綠原酸提取液進(jìn)行純化工藝研究，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，最終確定優(yōu)化工藝為上柱液濃度8.1 mg/mL，洗脫液濃度61%，用量2.7 BV，此條件下，解吸附率為91.9%。但是，聚酰胺層析法純化煙草綠原酸，在提高綠原酸純度的同時(shí)存在高成本、高耗時(shí)等問(wèn)題，因此對(duì)于如何降低廢次煙葉中高純度綠原酸提取成本的問(wèn)題將是下一步的研究重點(diǎn)。