慢性阻塞性肺疾病動物模型的研究與開發(fā)

羅玉馨，胡曉佳，曹竟尹，嚴成俊

(西安培華學院，西安 710125)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以長期氣流受限為主，其氣流受限多呈進行性發(fā)展，預防和根治比較困難。COPD的產(chǎn)生原因主要是人體氣道和肺部產(chǎn)生炎癥或有毒氣體進入肺部，最終導致COPD。其主要癥狀表現(xiàn)為患者出現(xiàn)慢性支氣管炎或肺氣腫[1-2]。這是一種可以使人喪失勞動能力甚至喪失生活自理能力的嚴重疾病。近年來，COPD的患病率和病死率在世界各國仍居高不下。預計10年后，COPD將成為全球三大死因之一[3-5]。COPD的長期治療將給患者和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[6]，故對其進行深入的研究具有現(xiàn)實意義。本實驗研究能否順利開展的主要前提是動物模型的成功建立，并深入研究和分析動物發(fā)生COPD的原因和規(guī)律，為治療和預防COPD提供科學的理論依據(jù)。

1 實驗動物的選取

構(gòu)建COPD動物模型的動物種類主要是嚙齒類動物，如豚鼠、小鼠、大鼠、倉鼠、斑點鼠等。而哺乳動物主要是兔、犬、羊、豬、猴等。其中，最常用的是小鼠和大鼠，但大鼠多作為發(fā)現(xiàn)病理機制的參考。

1.1 豚鼠

豚鼠嗅覺較靈敏，對各種刺激均會作出極敏感的反應，故在渾濁空氣中患肺炎的概率較高。此外，豚鼠的解剖特征與生理特征和人類高度相似，其主要表現(xiàn)為肺部呈左二右三的肺葉結(jié)構(gòu)，同時具有二分叉細支結(jié)構(gòu)。動物的變態(tài)反應與人類的炎癥反應基本相似，由于豚鼠肺損傷主要特征體現(xiàn)在軸突反射，而人類的肺損傷軸突反射情況并不顯著，加上豚鼠價格非常高，無法獲得更多的能夠供血給藥的豚鼠尾巴，所以豚鼠做為實驗動物的機會較低。

1.2 小鼠

小鼠體型較小，好飼養(yǎng)，繁殖時間短且繁殖后代多，可以在有限的空間進行大規(guī)模的養(yǎng)殖，十分有利于大規(guī)模實驗造模。此外，小鼠基因結(jié)構(gòu)較清楚，與人類在基因水平上高度同源?；虿輬D顯示，DNA鏈上的基因與基因之間的片段十分相似，兩物種基因?qū)俣荚?萬個左右。在進行小組實驗改造時，可采用易制備基因。對近交系小鼠進行實驗時，可直接排除掉遺傳變異的影響。按照本次實驗的目的要求，可以適當選擇一些敏感性較高品類的小鼠，或者選擇一些體內(nèi)含有豐富酶及抗體的品類小鼠，這有助于實驗中開展抗原鑒定測驗、免疫印跡測驗、胞流式測驗等其他檢測。有關文獻證明，不同品種的小鼠對煙霧的敏感性不同。Limjunyawong等[7]發(fā)現(xiàn)，BALB/cJ小鼠相對于C57BL/6J小鼠，對外源性蛋白酶刺激有更強的敏感性[8]。

1.3 大鼠

大鼠用作動物模型的優(yōu)缺點類似于小鼠。大鼠與小鼠相比較，大鼠的體積大，方便靜脈注射及進行肺組織和肺泡標本的采集。但大鼠肺部缺少支氣管黏膜下腺體，此特征與人體肺部結(jié)構(gòu)不同，所以大鼠僅可作為發(fā)現(xiàn)病理機制的參考。

1.4 其他鼠類

倉鼠、斑點鼠和金黃地鼠等品系的鼠種也能用于COPD模型[9]的構(gòu)建，但實驗試劑相對較少，動物價格較高，且易受到遺傳變異等因素的影響，實驗條件苛刻，不利于實驗的順利展開[6]，所以不作為造模動物實驗的首選動物。

1.5 其他動物

兔、犬、猴、羊、豬等動物雖與人類肺部結(jié)構(gòu)高度相似，但價格高，難飼養(yǎng)，顯然在數(shù)量巨大的造模動物實驗中并不適用。使雪貂的鼻子暴露在香煙煙霧(CS)下6個月后，雪貂就出現(xiàn)了一系列明顯的細菌感染的病理特征。例如，在清晨的時候，雪貂就出現(xiàn)了伴有氣道阻塞的咳嗽(自發(fā)性咳嗽)、慢性黏液高分泌以及以氣道為中心的細菌感染。雪貂的這些表征與大鼠、小鼠相比較，更接近于人類COPD的病理特征，但在檢測中卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯升高的組織阻尼，這個結(jié)果與人類患COPD的特征有很大差異，所以還需要做進一步研究[10]。

實驗動物的選取應滿足某些與人類相似的特征和生理結(jié)構(gòu)。通過動物實驗，對人類疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律進行推測和探究，故本試驗裝置系統(tǒng)選用結(jié)構(gòu)簡單又能直接反映研究指標的動物—小鼠。

2 構(gòu)建COPD的常用方法

在構(gòu)建COPD模型時，通常采用的方法包括煙草煙霧暴露法、基因改造法等，同時空氣污染物質(zhì)暴露法、多因素聯(lián)合誘導法也是構(gòu)建這種模型進行實驗的常用方法。有研究認為，吸煙為 COPD 最重要的誘導因素之一，所以通常情況下，在構(gòu)建這種模型時普遍會選擇煙草煙霧暴露法，以此達到較好的實驗效果。

2.1 氣道內(nèi)蛋白酶滴注法

肺組織能維持正常的結(jié)構(gòu)主要是由于蛋白酶和抗蛋白酶兩個重要因素的平衡，以保證其免受破壞和損傷。若某一方增加或減少，均會引起失衡，導致肺組織損傷。以蛋白酶誘導模型作為單一的致病因素，常用豬胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、人中性粒細胞彈性蛋白酶等。給予小鼠鼻內(nèi)單次滴注蛋白酶，產(chǎn)生的肺氣腫現(xiàn)象基本符合COPD的主要特征，此法容易誘導明顯的肺氣腫，顯著地體現(xiàn)出異常的肺功能現(xiàn)象。

2.2 基因改造法

環(huán)境污染以及吸煙問題導致人類患有COPD的情況越發(fā)嚴重。辛亞男等[11]研究結(jié)果說明吸煙是COPD重要誘導因素之一。但在吸煙人群中，并不是所有吸煙者都是患病者，個體易患因素應得到研究者的重視。當前，基因調(diào)控模型有很多類型，如基因過度表達模型、常見的基因缺失COPD模型以及自然基因變異模型。李麗球等[12]研究表明，在小鼠體內(nèi)，抗氧化酶與抗蛋白酶對其身體所產(chǎn)生的破壞程度有著很大的差異，因此通過改變動物的基因和COPD的發(fā)病機制，找出引發(fā)COPD的一些誘導原因，使實驗者發(fā)現(xiàn)更好的治療辦法。

2.3 多因素聯(lián)合法

單因素誘導方法于實驗中相對簡單經(jīng)濟且更易獲得可觀的實驗結(jié)果。但COPD患者病因復雜，且COPD有較高的分級，單一的造模方法耗時長，且難以同時模擬多種復雜的病理特征和生理病理改變情況，所以多因素聯(lián)合法更加省時省力，實驗中可以更好的模擬COPD的典型特征以及病理生理改變情況，以達到更穩(wěn)定的實驗效果。

2.4 腹腔注射法

在動物腹腔內(nèi)注射煙草煙霧提取化合物或者注射異種內(nèi)皮細胞。香煙煙霧提取物(CSE)容易制備，價格低廉，操作較簡單，而且建模時間短，可通過腹腔注射CSE來構(gòu)建COPD動物模型。將自制的CSE溶液于相隔的天數(shù)中注入等量的劑量，經(jīng)過12周的實驗期以后，實驗人員發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)肺功能下降情況，大鼠在3周后即誘導出COPD模型，其原因主要是由于小鼠體內(nèi)肺泡腔不斷變大，肺泡破損，周圍的細胞死亡數(shù)量也開始增加，導致肺功能下降，符合COPD模型的建立。腹腔注射異種內(nèi)皮細胞建立COPD模型，由于建模時間短，沒有出現(xiàn)顯著的病理變化。COPD發(fā)病機制為異種內(nèi)皮細胞使機體在一段時間后產(chǎn)生抗體細胞并逐漸增多，人體內(nèi)的免疫功能開始失衡，肺組織遭到破損，肺細胞死亡量開始逐漸增加，最終導致肺氣腫的發(fā)生。

2.5 脂多糖誘導法

在革蘭陰性菌細胞壁組成中，脂多糖是最主要的一種成分。脂多糖是一種內(nèi)毒素，可以刺激內(nèi)皮細胞、中性粒細胞以及單核細胞等釋放炎性介質(zhì)，使其發(fā)生反應，最終造成蛋白酶-抗蛋白酶失衡，嚴重損壞肺組織，導致肺氣腫。脂多糖的誘導模型常采用氣管內(nèi)滴注法，其建模時間較短，操作簡便，可以模擬COPD機制的急性加重反應，但不能模擬其慢性病變的過程，只能復制出COPD機制的部分病理特征，可與其他方法聯(lián)合使用[13]。

3 COPD試驗系統(tǒng)裝置的研究與開發(fā)

該裝置包括香煙煙霧的利用、整套工藝系統(tǒng)裝置的處理凈化(整套工藝系統(tǒng)外表面材料選用透明玻璃)。如圖1。

圖1 COPD試驗系統(tǒng)裝置Fig.1 COPD test system device

3.1 香煙煙霧發(fā)生器

進行實驗過程中，為確保香煙煙霧均勻地擴散到活動室頂部，通常情況下會將通風口設置到活動室下層的中間，這樣才可以確?；顒邮覂?nèi)的香煙煙霧完全進入動物肺部，被動物充分吸入，并保證動物能夠在一個舒適的環(huán)境中生存。

3.2 動物活動室

上層為動物活動室、食物投放盒以及飲水投放盒三個格擋。每個格擋均可單獨打開進行試驗操作、投放動物、投放動物食物、投放飲水等，操作靈活簡單。在動物活動室當中，實驗員安裝了兩個溫濕度裝置，同時還安裝了一個監(jiān)控裝置，進而方便實驗員通過監(jiān)控設備觀察動物在該場所中吸入CO的濃度、含氧量、溫度、濕度等關鍵參數(shù)。

3.3 香煙出口控制閥及通風口

進行實驗時，可以利用香煙出口控制閥或通風口抽屜對動物活動室內(nèi)的環(huán)境進行調(diào)節(jié)和控制。如可以控制和調(diào)節(jié)內(nèi)部環(huán)境CO的濃度參數(shù)，也可以調(diào)節(jié)環(huán)境內(nèi)含氧量參數(shù)等，使動物的生存環(huán)境能夠滿足實驗要求。

3.4 凈化罐

試驗裝置尾部凈化罐包含排煙管道、控制閥、風機、凈化罐。其中，凈化罐內(nèi)布置下層活性炭蓬松氈過濾網(wǎng)和上層活性炭蓬松氈過濾網(wǎng)，這兩個過濾網(wǎng)可以對沒有得到利用的相應環(huán)境進行凈化處理，保證周圍空氣不會對實驗環(huán)境造成污染以及影響試驗人員的健康。

此裝置可有效監(jiān)控整個實驗過程中煙霧的成分、濃度、溫度、濕度，同時使煙霧循環(huán)利用，徹底解決實驗過程中造成試驗效果欠佳的問題。

4 結(jié)語

建立動物模型的首要基礎是研究疾病的預防、新藥的研發(fā)以及新療法。裝置合格的模型可以使臨床研究順利開展。在實驗室的眾多研究成果中，該環(huán)節(jié)在臨床中的應用不可或缺。至今，我國醫(yī)藥技術行業(yè)仍然在持續(xù)尋找能夠與動物造模相匹配的辦法，以期實現(xiàn)規(guī)范化。目前，更符合COPD發(fā)病機制復雜的條件是應用復合因素造模，但需要通過多個方面標準的評價與考查，確定存在特殊病理的改變、通氣功能的限制等因素，來確定模型是否符合標準。

隨著科學技術的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，更先進的動物模型以及更全面的評價系統(tǒng)的出現(xiàn)可為后續(xù)研究COPD提供更多的幫助。