幽門螺桿菌在宿主間傳播途徑模型的初步研究

岑朝，杜秋穎，吳雪銘，蘇建偉，覃小珊，張文燕，魯禮靜，廖陽， 梁玉美▲

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西百色 533000； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染動物模型國內(nèi)外已進行了大量研究，但其在宿主間的直接傳播模型目前尚少有報道，許多研究認(rèn)為，幽門螺桿菌傳播主要有口-口傳播和糞-口傳播途徑，甚至有提出飛沫傳播的假設(shè)，但目前仍缺乏有力的直接證據(jù)。本研究模擬幽門螺桿菌在宿主間的傳播過程建立研究模型，為進一步揭示幽門螺桿菌感染途徑的研究打下基礎(chǔ)。

1 對象與方法

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，采用隊列研究方法，以采集含有Hp感染患者的胃黏膜、胃液、口腔含漱液、糞便標(biāo)本，隨之污染到自然環(huán)境的食物中，再分別在4 h、24 h、72 h、1 W、2 W等5個時間節(jié)點，分別灌喂SPF級小鼠2次，再適應(yīng)性喂養(yǎng)4 W后處死，通過胃黏膜組織切片檢測Hp的感染狀況及其炎癥程度，探索在食物環(huán)境中隨時間推移Hp是否還具備傳染及繁殖能力；為掌握Hp傳播規(guī)律提供直接證據(jù)。

從上消化道癥狀就診的當(dāng)?shù)鼐用癫±泻Y選志愿者，由接受培訓(xùn)的醫(yī)護人員進行面對面問卷調(diào)查，采集篩查對象的個人基本信息、生活方式、有無消化道病史、服藥史及腫瘤家族史等信息，并進行體格檢查。入圍標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②1個月內(nèi)未使用抗菌藥物和抑酸、制酸藥；③無心、腦、肺、肝、腎等重要臟器疾病的患者；④如正在服用抗凝血藥物，須停藥一周后檢查出凝血功能正常者；⑤患者按診療路徑行血清Hp抗體測定和C-尿素酶試驗，兩項試驗陽性者，確定為Hp現(xiàn)癥感染；⑥排除有胃鏡檢查禁忌證者。符合以上條件者納入研究對象，簽署實驗知情同意書、胃鏡檢查知情同意書。

內(nèi)鏡檢查前志愿者須禁食、禁水8 h以上。電子胃鏡嚴(yán)格清洗消毒、使用一次性無菌吸引管道和無菌標(biāo)本采集袋，避免污染。在電子胃鏡下以一次性無菌活檢鉗取患者的胃竇小彎2塊，胃竇大彎1塊，胃角2塊，胃體大彎1塊，胃體小彎1塊，胃底1塊，共采取8塊黏膜組織。 取胃小彎、胃角各1塊活檢標(biāo)本以10%福爾馬林固定送病理學(xué)檢查，HE或WS染色，記錄炎癥和Hp感染程度。余下6塊(胃竇大小彎各1、胃體大小彎各1、胃角1、胃底1塊)黏膜組織研磨：將胃黏膜放入經(jīng)高壓滅菌的研磨管中，加入5顆3 mm研磨磁珠，500 μL高壓滅菌生理鹽水作為研磨緩沖液，用mini-beadbeater16磁珠研磨儀進行研磨成混懸液，行快速Hp PCR檢測，陰性者剔除，將余下混懸液加入等量新鮮培養(yǎng)液中，置于4 ℃環(huán)境中備用做動物試驗。

清晨空腹行胃鏡檢查時胃腔內(nèi)胃液全部吸凈收集到專用收集袋中4 ℃保存，取以上混懸液行快速Hp PCR檢測，陰性者剔除；剩余的標(biāo)本加入等量新鮮培養(yǎng)液進入下一步動物試驗。

禁食8 h，清晨未漱口及飲水，使用0.9%氯化鈉溶液100 mL含漱并將含漱液吐入100 mL鹽水瓶中，4 ℃環(huán)境儲存并即送至實驗室；快速Hp PCR檢測，陰性者剔除，剩余的加入等量新鮮培養(yǎng)液進入下一步動物試驗。

收集病人的新鮮糞便(每人30～50 g),置入一無菌塑料袋中稱重;按重量體積比用預(yù)平衡的布氏肉湯配制25%的糞便懸液,用塑料袋封口機封口，糞便擠碎搖勻制成漿樣懸液;37 ℃,7000 r/min離心10分鐘，倒去上層液體，吸取含有糞便細(xì)菌的中間乳狀層，快速Hp PCR檢測，陰性者剔除；剩余的加入等量新鮮培養(yǎng)液進入下一步動物試驗。

以Hp陰性志愿者的胃黏膜、胃液、口腔含漱液、糞便標(biāo)本，同法處理，PCR檢測各標(biāo)本均為陰性者為對照。

(1)SPF級C57BL/6小鼠從長沙市天勤生物技術(shù)有限公司購買，雄性，體重18～22 g，平均體重20 g，周齡8 W。先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 W，再將所有實驗小鼠斷食、水12 h；飼料由右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，統(tǒng)一配制的蒸餾水。選擇其中1例Hp感染者胃黏膜、胃液、糞便、含漱液標(biāo)本PCR檢測陽性者接上述制備好實驗標(biāo)本，與鮮牛奶1∶1混勻后，食物于20 ℃～25 ℃室溫下放置4 h、24 h、72 h、1 W、2 W，每組15只實驗小鼠分別取以上標(biāo)本0.5～1.0 mL/只灌喂，共2次，每次間隔1 h，繼續(xù)斷食、水4 h；之后正常進食，繼續(xù)喂養(yǎng)4 W。同時取Hp陰性組的1例志愿者胃黏膜、胃液、糞便經(jīng)PCR篩查均陰性的標(biāo)本混合、污染處理的鮮牛奶，分別放置4 h、2 W后同樣方法各灌喂實驗小鼠，每組10只小鼠。剔除實驗過程中死亡的實驗小鼠，最后將完成實驗的小鼠處死進行解剖取全胃做病理學(xué)檢測。(2)對實驗小鼠的胃黏膜組織病理學(xué)檢查。取實驗小鼠胃縱切進行病理切片HE染色(鑒別困難時Warthin-Starry染色)，行Hp檢測及病理炎癥程度半定量檢測；病理分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻，感染分級：Hp感染，高倍鏡檢，切片中未發(fā)現(xiàn)Hp為陰性；多個視野僅發(fā)現(xiàn)稀疏分布的Hp，為輕度感染；幾乎每個視野都可發(fā)現(xiàn)散在分布的Hp，為中度感染；視野中有較多的Hp，為重度感染。

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料用例(%)表示，兩兩組間比較采用四格表χ檢驗，<40或存在理論頻數(shù)<1，則采用Fisher精確概率法；多個組間比較采用行×列表χ檢驗，存在理論頻數(shù)<1或理論頻數(shù)在1和5之間的格子數(shù)超過所有格子總數(shù)1/5，則采用Fisher精確概率法。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) 果

本研究招募志愿者，行C呼氣試驗及胃黏膜組織病理學(xué)HE染色，2項陽性確定為Hp感染者(A組)，2項均為陰性為非Hp感染組(B組)，僅1項陽性剔除，最后符合納入研究26例，A組12 例，B組14例。入組患者年齡范圍在37歲至84歲之間。兩組志愿者分別采集胃黏膜、胃液、含漱液、糞便標(biāo)本采用PCR檢測進行Hp篩查，結(jié)果如表1：A組采集的標(biāo)本PCR檢測Hp陽性率由高到低依次為胃黏膜、糞便、胃液，提示以上3種標(biāo)本有Hp存在，胃黏膜、糞便標(biāo)本與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)，但胃液標(biāo)本差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)；口腔含漱液標(biāo)本PCR檢測均陰性，提示沒有Hp DNA物質(zhì)存在，故唾液標(biāo)本不再進入下一環(huán)節(jié)動物實驗；B組所有各標(biāo)本PCR檢測均陰性。

表1 患者標(biāo)本PCR Hp篩查試驗結(jié)果

自幽門螺桿菌感染患者胃黏膜標(biāo)本各時間點均有Hp感染到實驗小鼠，概率為14.29%～38.46%，各時間點感染概率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=0.682)；胃液標(biāo)本雖然只有2例PCR檢測陽性(存在Hp)，但取其陽性標(biāo)本用于污染食物后亦能經(jīng)過食物傳染給實驗小鼠，各時間點感染概率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=0.658)；糞便標(biāo)本有7.69%～18.18%可經(jīng)過食物傳染給實驗小鼠，各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=1.000)；對照組(以4 h和2 W兩個時間點實驗)無一例感染Hp。各組小鼠Hp傳染的概率見表2。

表2 不同標(biāo)本及不同時間節(jié)點Hp傳染的概率

續(xù)表2

合計各時間點的各類標(biāo)本中Hp傳染概率結(jié)果見表3。胃黏膜、糞便、胃液來源的Hp傳染概率依次遞減，三者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ=6.721，=0.035)；兩兩比較，胃黏膜與糞便標(biāo)本傳染概率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而胃黏膜與胃液來源比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，糞便與胃液來源比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各標(biāo)本來源Hp污染食物后傳染性比較

3 討 論

幽門螺桿菌已被確定為慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病菌，是胃癌癌前病變(萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃黏膜上皮內(nèi)瘤變)的重要病因，與胃腺癌、黏膜相關(guān)淋巴瘤(MALT)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，1994年，Hp已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為Ⅰ類致癌原；2015年《幽門螺桿菌胃炎京都全球共識》的指出Hp胃炎是一種傳染性疾病，存在人傳染人現(xiàn)象。業(yè)已證明，幽門螺桿菌一旦感染后將在胃黏膜表面及其小凹中定植，形成難以自我清除的慢性感染，是胃腸道及腸道外幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的致病因子。本研究證明了隨糞便排出體外的Hp在濕潤食物中2 W內(nèi)可以生存并成功感染動物胃黏膜及胃小凹表面。

眾所周知，在個體之間傳播或傳染的病原微生物，通過阻斷傳播途徑，是最有效的防治措施，降低Hp人群感染率也不例外。但由于幽門螺桿菌確切傳播途徑目前仍知之甚少，尚難以在阻斷傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上精準(zhǔn)施策，導(dǎo)致一些措施可行性差，如家庭成員間如何阻斷傳播，不可能簡單將家庭成員隔離。Hp傳播可能與不同人種、民族、年齡、地域環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活習(xí)俗以及不同的社會活動接觸方式等諸多因素有關(guān)。全球有很多關(guān)于Hp感染率的橫斷面研究，在眾多研究進行年齡分組分析大致得出一個結(jié)論：從新生兒期開始感染率隨年齡增長而逐漸遞增，40～50歲時達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，且發(fā)展中國家感染患病率隨年齡增長迅速增加，而在發(fā)達(dá)國家，Hp感染在兒童時期較低，隨著年齡的增長而緩慢增加。廣西百色市的一項研究發(fā)現(xiàn)，在321名壯族學(xué)齡前兒童中HpSA檢測陽性者83例(25.9%)，3歲、4歲、5歲、6歲的陽性率分別為15.79%、20.27%、26.43%、34.95%，而在該地區(qū)成人的感染率約為42.09%，在成人的各年齡組中感染率無差異，可見阻斷幽門螺桿菌感染的關(guān)鍵時期為兒童時期；只有掌握其傳播的主要途徑規(guī)律，才能精準(zhǔn)干預(yù)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜、胃液及糞便標(biāo)本在體外2 W內(nèi)不同時間點均可經(jīng)食物傳播途徑傳播Hp，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；胃黏膜中的Hp傳播總的概率(24.48%)高于糞便標(biāo)本(14.06%)，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；糞便來源的Hp感染率似乎高于胃液來源者，但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，提示糞便內(nèi)Hp的傳染性與胃黏膜的Hp相當(dāng)，而空腹中抽取的胃液內(nèi)的Hp可能受胃酸的作用后傳染性下降。而口腔含漱液中，Hp篩查無DNA物質(zhì)存在，提示經(jīng)唾液傳播可能十分罕見，有待增加實驗例數(shù)進一步證實；對照組陰性標(biāo)本中無一例被傳染，進一步證實上述實驗標(biāo)本中含有可致病Hp的食物攝入，可經(jīng)口傳染到下一宿主的胃黏膜定植感染。 綜合上述，推測Hp可在胃內(nèi)隨著胃液、食物混合，可耐受各種消化酶的作用，經(jīng)腸道隨糞便排出，成為公眾日常宿主間傳染的最主要途徑。同時，Hp從胃黏膜到體外過程，傳染能力可能有所遞減。

口-口傳播方式曾被認(rèn)為是發(fā)達(dá)地區(qū)家庭內(nèi)傳播的重要途徑。許多研究假設(shè)胃液中的Hp可能通過嘔吐、胃食管反流進入口腔并滯留在口腔唾液、牙齦、牙斑上，然后通過唾液傳播。有研究發(fā)現(xiàn)Hp可以在唾液中培養(yǎng)出來，牙齒的牙菌斑、口腔、食道、扁桃體組織中也可以培養(yǎng)出來，這也就支持人類傳播可能通過口-口途徑進行的觀點， KIVI等對39個家庭104名對象進行調(diào)查提示，除了母子/女、兄弟姐妹間直接傳播，配偶間可能通過共用生活用具、接吻傳播。SGAMBATO等研究結(jié)果顯示，幽門螺桿菌感染的性伴侶中幽門螺桿菌感染率為74.5%，而對照組幽門螺桿菌感染率為32.3%。FURUTA等對日本五個家庭的所有成員包括父母和孩子共19個Hp菌株的全基因測序研究，檢測核苷酸替換情況以顯示可能存在的傳播途徑，發(fā)現(xiàn)每個家庭均存在全基因測序完全相同或多位點序列分型(MLST)中多位點序列非常相似的菌株，說明Hp通過接觸感染，其中4個家庭中的子女感染菌株來自其母親或父親，但值得注意的是，其中1個家庭的Hp感染菌株并非來自他們的父母，而是來自家庭外并且在3個子女中為同一菌株，進一步證實Hp感染是在家庭成員中的密切接觸而感染，但感染源不一定是來自父母，也可能是來自同一環(huán)境感染如水源、食物等，也可能是其中一個感染后傳播給其他兄弟姐妹。雖然許多研究間接支持口-口傳播途徑，但當(dāng)前研究缺少充分的直接證據(jù)，共同生活及密切接觸同樣增加糞-口途徑的傳播。本研究通過PCR檢測，在胃液中發(fā)現(xiàn)Hp存在(16.67%)，但無論是Hp陽性還是陰性者，其唾液中均未檢測到Hp遺傳物質(zhì)存在，提示口-口傳播罕見，作為主要途徑的假說仍存在爭議。

隨著研究的不斷深入，糞-口傳播方式被認(rèn)為是發(fā)展中國家的主要傳播途徑，早期LAPORTE等在法國開展一項隊列研究發(fā)現(xiàn)，福利院中青少年腹瀉期間可發(fā)生Hp傳播。PCR檢測同一患者糞便和胃黏膜分離菌株的cagA基因和空泡毒素信號序列s1a基因(vacA s1a)一致，在人末段結(jié)腸和直腸的分泌物中均可培養(yǎng)得到Hp。這為糞-口傳播提供了生物學(xué)依據(jù)。本研究可以顯示，被胃黏膜、糞便以及胃液來源Hp直接污染的食物，在體外放置14天內(nèi)，均可使實驗小鼠感染，也支持糞-口傳播為主要傳播途徑的觀點。

污染的飲用水、食物攝入的行為，可能是Hp傳播途徑的主要環(huán)節(jié)。根據(jù)幽門螺桿菌的流行病學(xué)特征，如在封閉的家庭和生活群體中存在較高的感染率，除了直接傳播外，這種細(xì)菌還可能通過一個共同的來源間接傳播，例如通過食用同一桌的同一種食物等。有研究證實了幽門螺桿菌在水、牛奶、即食食品、蔬菜、巴氏滅菌蘋果和橙汁、絞碎的牛肉和干發(fā)酵香腸中存活，其存活方式仍有待研究，例如蔬菜盡管有表面暴露在氧氣和干燥環(huán)境中及大量天然菌群的存在等不利條件，但Hp能形成生物膜而繼續(xù)存活下來，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)Hp感染在衛(wèi)生條件較差的地理區(qū)域更普遍，更易被細(xì)菌污染食物。因此，Hp也被認(rèn)為是一種食源性致病菌。

病原菌導(dǎo)致傳染病發(fā)生的基礎(chǔ)是病原菌成功定植傳染，與菌株類型、黏附能力、體外環(huán)境生存能力、感染人體細(xì)菌數(shù)量、靶器官微環(huán)境、宿主免疫等因素有關(guān)， Hp的傳染也應(yīng)遵循這一規(guī)律。Hp是一種螺旋狀、微需氧的革蘭陰性菌，細(xì)菌具有鞭毛結(jié)構(gòu)，全球約有50%的人員胃內(nèi)可測出Hp的定植，然而只有約15%的感染者出現(xiàn)臨床癥狀。不同菌型的Hp可能存在不同的傳染能力及致病作用，目前認(rèn)為具有細(xì)胞毒素相關(guān)基因致病島(CagPAI)相關(guān)基因表達(dá)的菌株具有更強的傳播能力及致病性，Hp與胃黏膜上皮細(xì)胞黏附后，細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)表達(dá)的CagA蛋白和其他毒力因子通過4型分泌系統(tǒng)(T4SS)注射至細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致宿主胃黏膜上皮細(xì)胞一系列的病理活動，使胃黏膜上皮細(xì)胞的緊密連接和細(xì)胞的極性功能紊亂，從而有效地定植并發(fā)生炎癥反應(yīng)。胃微環(huán)境對Hp定植能否成功也有明顯關(guān)系，腸道微生物群和宿主反應(yīng)之間的交互作用構(gòu)成人體胃內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其機制可能與腸道微生物群與宿主胃腸道抗菌肽(AMPs)之間的協(xié)作關(guān)系，抑制入侵的微生物定植。在Hp感染的個體中，腸道微生物可能會轉(zhuǎn)移，以促進胃炎癥和相關(guān)疾病發(fā)生，AMPs在對Hp的先天免疫反應(yīng)中具有重要意義，并與復(fù)雜的微生物群共同參與保守進化。氧化三甲胺(TMAO)是一種與飲食相關(guān)的微生物代謝物，與炎癥和代謝性疾病有關(guān)，WU等研究顯示，體外實驗TMAO不僅增加了Hp生長代謝相關(guān)基因的表達(dá)和脲酶活性，而且增加了毒力因子的產(chǎn)生；動物實驗提示TMAO的攝入，增加了Hp感染小鼠的炎癥標(biāo)志物的產(chǎn)生，并降低了腸道菌群的豐富度和多樣性;提示TMAO可能通過增加幽門螺桿菌的生存能力和毒力來加重幽門螺桿菌誘導(dǎo)的炎癥，并可能與Hp感染小鼠的腸道微生物群相關(guān)。HUANG等研究表明，丁酸(SB)是一種與飲食有關(guān)的微生物代謝產(chǎn)物，與炎癥、代謝綜合征和其他疾病有關(guān)，體外實驗表明，SB不僅能抑制幽門螺桿菌的生長，還能降低CagA和VacA的mRNA表達(dá)。攝入SB可減少幽門螺桿菌感染小鼠毒力因子的產(chǎn)生，通過降低Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)的表達(dá)抑制IκBα/NF-κB通路，并減少TNF-α和IL-8的產(chǎn)生。這2項研究顯示飲食衍生的代謝產(chǎn)物如TMAO和SB對Hp感染及其誘導(dǎo)的疾病發(fā)展產(chǎn)生促進或抑制的影響，即胃內(nèi)微環(huán)境可對Hp的定植及致病作用的影響。

關(guān)于宿主免疫反應(yīng)對Hp感染的影響機制也未完全清楚。其中Hp感染的免疫因子的關(guān)系研究較多，包括白細(xì)胞介素類(IL)、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)、高敏C反應(yīng)蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，DEWAYANI等發(fā)現(xiàn)IL-23在Hp感染患者中的表達(dá)，與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)，且IL-23與IL-21、IL-17一起直接或間接地在炎癥部位形成中起作用。Hp感染患者胃上皮細(xì)胞中IL-10作為抗炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平與CagA基因型有關(guān)，且Hp CagA基因型與胃炎患者胃上皮細(xì)胞IL-10基因表達(dá)增加之間呈正相關(guān)。YU等研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染兒童IL-8、IL-18和IFN-γ的表達(dá)水平顯著高于非Hp感染兒童。此外，還有研究表明，慢性胃炎患者血清hs-CRP水平升高。TEMESGEN等研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染的消化不良患者的高密度脂蛋白(HDL)降低和hs-CRP水平升高可能增加動脈粥樣硬化、內(nèi)皮功能障礙和其他心血管疾病的風(fēng)險，可能是由于Hp含有各種毒力因子，如CagA和VacA。CagA是一種由幽門螺桿菌產(chǎn)生的高毒力因子，在Hp誘導(dǎo)的炎癥中具有更大的作用，引起胃和胃外低度全身炎癥。

本研究尚未覆蓋Hp傳播的全程，在動物實驗中僅以1例感染者的菌株進行建模，未對菌株類型進行篩選、比較，同時研究的規(guī)模有限，但仍然可以得出明確的結(jié)論， Hp感染者的Hp可以適應(yīng)腸道環(huán)境隨糞便排出體外，再污染食物或水源，實現(xiàn)人與動物之間的傳播?？梢酝茰y糞-口傳播可能是人與人之間Hp傳播最常見、最基本的途徑。

綜上所述，幽門螺桿菌感染主要途徑可能以糞-口傳播為主，口-口傳播可能只是偶然事件。糞-口傳播途徑的主要環(huán)節(jié)可能是：體內(nèi)(胃黏膜→食物→腸道→糞便)→體外(污染食物或飲用水→進食)→下一宿主胃黏膜。下一步需要增加動物模型實驗規(guī)模，并綜合運用Hp分離培養(yǎng)、全基因測序分型及溯源、胃黏膜微環(huán)境、宿主免疫應(yīng)答等結(jié)合的系統(tǒng)研究，積累更多的證據(jù)鏈加以證實。