食品相關(guān)納米粒子蛋白冠的形成及生物學(xué)效應(yīng)

譚明乾,劉榮剛,崔國(guó)馨,宋玉昆

(大連工業(yè)大學(xué)食品交叉科學(xué)研究院/食品學(xué)院/國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116033)

近年來,隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展,納米粒子(nanoparticles)由于具有較小的尺寸(1～100 nm)、較大的比表面積、豐富的表面基團(tuán)、良好的反應(yīng)活性以及獨(dú)特的光學(xué)性能等,被應(yīng)用于食品添加劑和食品包裝的內(nèi)襯材料中[1]。例如,SiO2納米粒子被用于奶粉、咖啡粉和蛋糕粉中防止其結(jié)塊、保持其流動(dòng)特性[2];TiO2納米粒子被用作白色粉末狀食品(如調(diào)味品)的增白劑[3];Ag和ZnO納米粒子也被用于食品包裝材料中,提高其抗菌和抗氧化性能,延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[4]。除了在食品中添加的外源性人造納米粒子,有學(xué)者還在經(jīng)過加工處理的食品中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性納米粒子,包括調(diào)味品、飲料、肉類、海鮮等[5]。這些納米顆粒稱為食品相關(guān)納米粒子(food-related nanoparticles,FNP),并與食品安全和生命健康息息相關(guān)。所以,研究FNP與生物成分之間的相互作用具有重要意義。

當(dāng)FNP進(jìn)入生物環(huán)境后,由于其獨(dú)特的性質(zhì),與含有生物大分子的血液、淋巴液以及組織液接觸后,FNP表面會(huì)被體液中的蛋白質(zhì)、多糖以及脂質(zhì)等生物大分子覆蓋,這種新形成的冠層結(jié)構(gòu)被稱為蛋白冠[6]。FNP的性質(zhì)影響蛋白冠的形成及生物大分子的吸附,并影響其在體內(nèi)的毒性。例如,Ding等[7]報(bào)道蛋白冠的形成可以改變細(xì)胞免疫反應(yīng),不同的FNP形成蛋白冠后對(duì)納米粒子免疫激活機(jī)制的影響不同。Treuel等[8]指出,蛋白冠可以抑制納米粒子與細(xì)胞膜的結(jié)合和被吸收,減輕納米粒子的毒性。蛋白冠的形成可以改變食品添加劑和食品加工過程中所產(chǎn)生的FNP在進(jìn)入人體后的細(xì)胞毒性、分布和不良影響。因此,了解納米粒子蛋白冠的特征、形成機(jī)制及其對(duì)免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性的影響至關(guān)重要。

本文首先介紹了納米粒子蛋白冠的基本信息,包括蛋白冠的分類、檢測(cè)方法、組成和影響因素,然后綜述了蛋白冠在體外細(xì)胞模型中對(duì)納米粒子的細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)影響的最新進(jìn)展,最后對(duì)食品相關(guān)納米蛋白冠的研究方向進(jìn)行了展望。

1 蛋白冠的基本信息

1.1 蛋白冠的分類

進(jìn)入生物環(huán)境中的納米粒子與蛋白質(zhì)形成蛋白冠是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,且隨著時(shí)間的變化,蛋白質(zhì)在納米粒子表面不斷吸附又不斷解離。根據(jù)Vroman[9]在1962年提出的觀點(diǎn),不同種類的蛋白質(zhì)在納米粒子表面的親和力不同,吸附和解離的速率也不同[10]。目前的研究觀點(diǎn)是,根據(jù)蛋白質(zhì)層在NP表面結(jié)合的位置和吸附強(qiáng)度,蛋白冠是由硬質(zhì)蛋白冠、軟質(zhì)蛋白冠和界面蛋白冠共同組成[11]。一般來說,軟質(zhì)蛋白冠不如硬質(zhì)蛋白冠的物理性質(zhì)穩(wěn)定,所以目前對(duì)于硬質(zhì)蛋白冠的研究較多。納米粒子進(jìn)入人體后,蛋白質(zhì)在其表面形成蛋白冠,賦予其全新的生物學(xué)特性。蛋白冠形成過程主要是由多種相互作用力共同驅(qū)動(dòng)的,包括范德華力、分子間疏水、π-π作用力、靜電和氫鍵相互作用等[12]。如圖1所示:在生物環(huán)境中蛋白冠的形成其實(shí)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,隨著時(shí)間的變化,不同蛋白質(zhì)與納米粒子相互結(jié)合又分離[13]。軟蛋白冠中的蛋白與納米粒子的結(jié)合強(qiáng)度比較差,穩(wěn)定性差,被認(rèn)為具有高轉(zhuǎn)化率,并容易在生物環(huán)境中被具有更強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì)所取代[11]。隨著蛋白冠在生物環(huán)境中的轉(zhuǎn)移,由于吸附平衡的轉(zhuǎn)移趨向,親和力較高的蛋白質(zhì)更容易在納米粒子的表面聚集,從而形成硬蛋白冠。例如,血液中最豐富的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)對(duì)納米粒子的親和力較低,很容易被載脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ和E所取代[13]。還有一種情況是位于硬質(zhì)蛋白冠層下,緊密結(jié)合在納米粒子表面,可以通過強(qiáng)力清洗硬質(zhì)蛋白冠層而形成 “界面”蛋白冠[14]。蛋白冠的類型影響細(xì)胞受體對(duì)納米粒子的識(shí)別,從而影響細(xì)胞對(duì)納米粒子的吸收。研究人員在定性或定量研究硬蛋白冠和軟蛋白冠之間的變化方面做了許多工作,為預(yù)測(cè)蛋白冠的體內(nèi)狀態(tài)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

圖1 納米粒子在生物環(huán)境中形成蛋白冠的過程[13]Fig.1 Formation of protein corona of nanoparticles in biological environment[13]A. 納米粒子進(jìn)入到生物環(huán)境中還未形成蛋白冠;B. 隨著時(shí)間的推移,蛋白質(zhì)吸附在納米粒子上,形成硬質(zhì)蛋白冠;C. 更多的蛋白質(zhì)吸附在納米粒上并不斷交換達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,形成硬質(zhì)和軟質(zhì)蛋白冠。A. Nanoparticles enter the biological environment without forming a protein corona;B. As time goes by,protein adsorbs on the nanoparticles to form hard protein corona;C. More proteins are adsorbed on the nanoparticles to form hard protein corona and soft protein corona,and achieve dynamic equilibrium.

1.2 蛋白冠的分析檢測(cè)方法

目前對(duì)于蛋白冠的主要研究方法分為定性和定量分析兩大類。定性方法有Zeta電位測(cè)定、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)、動(dòng)態(tài)光散射、原子力顯微鏡分析法等。例如,通過TEM可以觀察到納米粒子與血清中的蛋白質(zhì)形成蛋白冠后,附著在納米粒子表面的一層蛋白質(zhì)[15]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯納米粒子與胃蛋白酶形成蛋白冠后,Zeta電位測(cè)定顯示,其電位相對(duì)于形成之前發(fā)生顯著提高,說明形成蛋白冠后的體系趨于穩(wěn)定。Liu等[17]研究表明檸檬酸涂層的Ag納米粒子可與細(xì)胞內(nèi)蛋白形成蛋白冠,用圓二色譜(circular dichroism,CD)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),納米氧化石墨烯存在復(fù)雜的sp2雜化結(jié)構(gòu),可以與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用進(jìn)而形成蛋白冠。Catalano等[18]通過動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)SiO2納米粒子與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)形成蛋白冠的情況,發(fā)現(xiàn)SiO2納米粒子形成蛋白冠后粒徑發(fā)生明顯變化。Li等[19]通過原子力顯微鏡觀察到ZnO納米粒子與BSA相互作用后形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯的變化,證明了蛋白冠的形成。蛋白冠定量方法有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[20]、等溫滴定量熱法[21]、表面等離子體共振法[22]等。這些方法可用來確定蛋白冠中的蛋白種類、吸附熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的參數(shù)等。為了全面認(rèn)識(shí)和了解蛋白冠的性質(zhì),需要將多種技術(shù)配合使用,直接或間接地研究蛋白冠的不同性質(zhì)及組成。

1.3 蛋白冠的組成

蛋白冠的組成取決于相互作用的環(huán)境,包括蛋白質(zhì)和納米粒子的種類。Lesniak等[23]在無血清培養(yǎng)基中回收的蛋白冠中發(fā)現(xiàn)其可結(jié)合800多種蛋白,主要為細(xì)胞質(zhì)蛋白。表1總結(jié)了在食品添加劑中不同類型的納米粒子上形成的蛋白冠中含量最高的5種蛋白質(zhì)[24-29]。Tenzer等[24]發(fā)現(xiàn)SiO2納米粒子在血漿形成的蛋白冠中含量最多的蛋白為載脂蛋白,之后依次為補(bǔ)體C3、補(bǔ)體因子H、纖連蛋白和載脂蛋白A。用氨基和羧基修飾SiO2納米粒子后,蛋白冠含量最多的蛋白除了載脂蛋白和補(bǔ)體C3,其他蛋白變化顯著。用氨基和羧基修飾SiO2納米粒子后,前2種最豐富的蛋白沒有變化,后面3種蛋白變化顯著。這說明納米粒子的表面化學(xué)性質(zhì)會(huì)影響蛋白冠的組成。表面修飾和蛋白質(zhì)種類都會(huì)影響蛋白冠的組成,甚至男女血漿的差異也會(huì)影響各種吸附蛋白的含量。在胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)TiO2形成的蛋白冠中補(bǔ)體C3含量較高,其次為纖溶酶原和白蛋白。如果在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ZnO納米粒子,前3種蛋白質(zhì)為α-1抗蛋白酶、α-2巨球蛋白和載脂蛋白A-I前體蛋白。這些結(jié)果表明,納米粒子的類型和表面化學(xué)性質(zhì)會(huì)顯著影響蛋白冠的組成,蛋白冠的復(fù)雜組成也取決于納米粒子所處的生物流體環(huán)境。

表1 在人血漿和胎牛血清中吸附在各種納米粒子中含量最多的5種蛋白質(zhì)Table 1 The five most abundant proteins in various nanoparticles in human plasma and fetal bovine serum(FBS)

1.4 影響蛋白冠形成的因素

就目前的研究文獻(xiàn)來看,影響蛋白冠的形成因素主要有2個(gè)方面:1)納米粒子的自身性質(zhì),包括其尺寸,形狀和表面的化學(xué)性質(zhì)等;2)納米粒子周圍的環(huán)境因素,包括作用時(shí)間、溫度、pH值和蛋白濃度等。

1.4.1 納米粒子自身性質(zhì)對(duì)蛋白冠形成的影響納米粒子的尺寸大小影響蛋白質(zhì)結(jié)合效率,從而影響蛋白質(zhì)的吸附量。納米粒子的尺寸效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)吸附很敏感,蛋白質(zhì)吸附隨納米粒子的大小而變化。Abdelkhaliq等[30]認(rèn)為較大的納米粒子空間位阻和較小的表面曲率,可以吸附更多的蛋白質(zhì)。例如對(duì)于Ag納米粒子來說,由于表面曲率不同,100 nm的Ag納米粒子比20 nm的所吸附的蛋白質(zhì)含量更高[26]。但也有學(xué)者提出了相反的觀點(diǎn),尺寸較小的納米粒子由于具有較高的比表面積,從而具有更強(qiáng)的蛋白吸附能力,例如隨著TiO2納米粒子尺寸的增加,其表面所吸附的血清蛋白含量逐漸下降[31]。

納米粒子的形狀對(duì)吸附在納米粒子表面的蛋白質(zhì)的數(shù)量和類型有顯著影響。例如SiO2納米棒和球形納米粒子的孔隙度、表面電荷、尺寸大小等基本的性質(zhì)相同。Visalakshan等[32]發(fā)現(xiàn),在血漿和血清中培養(yǎng)后,SiO2納米棒吸附的蛋白質(zhì)含量高于球形SiO2納米粒子。然而Deng等[33]發(fā)現(xiàn)橢圓形TiO2納米粒子與人血漿孵育后主要吸附免疫球蛋白M和G,而棒狀TiO2與人血漿孵育后主要吸附纖維蛋白原。

不同的表面化學(xué)修飾可以改變納米粒子的表面電荷和疏水性能,影響蛋白冠的組成。目前主要修飾納米粒子的官能團(tuán)主要有氨基、羧基和聚乙二醇(PEG)等。Abdelkhaliq等[30]發(fā)現(xiàn),經(jīng)過帶負(fù)電荷的羧基表面修飾后,聚苯乙烯納米粒子表面的蛋白質(zhì)組成與未經(jīng)修飾的納米粒子有所不同,其中結(jié)合蛋白、載脂蛋白和急性期蛋白在羧基化的納米粒子上大量富集,而α-2巨球蛋白、α-胎蛋白、載脂蛋白A-II、β-2-糖蛋白1和血紅蛋白胎兒亞基β蛋白在羧基化納米粒子上的吸附明顯減少。Walkey等[34]發(fā)現(xiàn)Au納米粒子經(jīng)過PEG修飾后,超過70種血清蛋白被吸附在Au納米粒子表面,這些吸附蛋白的相對(duì)密度取決于納米粒子大小和聚乙二醇接枝密度。

1.4.2 環(huán)境因素對(duì)蛋白冠形成的影響一般來說,蛋白冠形成的影響因素主要包括pH值、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)濃度、種類和數(shù)量。酸堿度會(huì)影響蛋白質(zhì)對(duì)納米粒子的親和力,pH值對(duì)蛋白質(zhì)與納米粒子結(jié)合的相互作用強(qiáng)度有顯著影響,進(jìn)而改變蛋白冠的組成。Devineau等[35]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)pH值為7時(shí),血紅蛋白在SiO2納米粒子上形成硬蛋白冠,而當(dāng)pH值為9時(shí),硬蛋白冠轉(zhuǎn)化為軟蛋白冠,這說明血紅蛋白在SiO2納米粒子上的解離和吸附與pH值相關(guān)。Xu等[36]在模擬血液、肺部和胃液(pH值分別為7.4、4.5和2.0)的環(huán)境下研究BSA在TiO2納米粒子上的吸附情況,發(fā)現(xiàn)BSA在TiO2納米粒子上的吸附高度依賴所處環(huán)境的pH值,并且在酸性條件下,培養(yǎng)基中磷酸鹽離子降低了納米粒子上BSA的變性程度。

綜上可知,蛋白冠的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),納米粒子上所吸附的蛋白質(zhì)不斷發(fā)生變化,所以孵育時(shí)間是影響蛋白冠上的蛋白質(zhì)豐度的重要因素。Tenzer等[24]報(bào)道,在SiO2納米粒子與人血漿形成的蛋白冠高度依賴于孵育時(shí)間,能夠在30 s內(nèi)迅速形成含有300多種蛋白質(zhì)的蛋白冠,并隨著時(shí)間的推移,蛋白質(zhì)的數(shù)量發(fā)生顯著變化。Pisani等[37]在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)探究了SiO2納米粒子在HSA和BSA中形成蛋白冠的情況,發(fā)現(xiàn)在30 s與在7 d 時(shí)吸附在納米粒子表面的蛋白質(zhì)組成不同,前期占比較低的蛋白質(zhì)在后期含量逐漸增多,這也證明了隨著時(shí)間推移蛋白冠上的蛋白質(zhì)不斷解吸又不斷吸附。

培養(yǎng)環(huán)境中的蛋白質(zhì)濃度會(huì)影響納米粒子和蛋白質(zhì)的吸收,導(dǎo)致蛋白冠組成和穩(wěn)定性的差異。例如,Ghavami等[38]發(fā)現(xiàn)當(dāng)SiO2納米粒子與梯度濃度的人血漿蛋白相互作用時(shí),SiO2納米粒子所吸附的蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量及其對(duì)納米粒子的親和性存在顯著差異。Monopoli等[39]也發(fā)現(xiàn)SiO2納米粒子在血漿濃度為20%～40%時(shí),蛋白冠上的載脂蛋白和補(bǔ)體蛋白含量迅速下降。因此,蛋白質(zhì)冠的組成高度依賴于蛋白質(zhì)的初始濃度、組成和狀態(tài)以及孵育條件等因素?？傊?蛋白冠的形成是納米粒子、蛋白質(zhì)和外部環(huán)境綜合作用的結(jié)果。

2 蛋白冠的理化特性及生物學(xué)效應(yīng)

2.1 蛋白冠對(duì)納米粒子理化特性的影響

當(dāng)納米粒子與蛋白質(zhì)形成蛋白冠后,納米粒子表面物理化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變,蛋白質(zhì)的吸附會(huì)影響納米粒子的完整性[40],同時(shí)由于蛋白質(zhì)的吸附會(huì)改變納米粒子上原有的表面化學(xué)基團(tuán),使具有特殊化學(xué)基團(tuán)的納米粒子無法充分表達(dá)其性質(zhì),這會(huì)大大影響納米粒子在生物環(huán)境中的分布和代謝行為[41]。Sasidharan等[42]發(fā)現(xiàn)Ag納米粒子蛋白冠的形成與纖維蛋白原的形成密切相關(guān),而纖維蛋白原會(huì)立即引發(fā)Ag納米粒子的聚集。Ho等[43]發(fā)現(xiàn)HSA、載脂蛋白A、免疫球蛋白G和纖維蛋白原在低濃度下會(huì)引起Au納米粒子的聚集。Linse等[44]發(fā)現(xiàn)增加人β(2)-微球蛋白的濃度也會(huì)促進(jìn)納米粒子的聚集,并且其表面輔助成核效應(yīng)提高了納米粒子的聚集概率,導(dǎo)致原本低毒性的納米粒子由于其聚集效果造成體內(nèi)排出受阻,毒性提高?？傊?蛋白冠的形成可以對(duì)納米粒子產(chǎn)生不可忽視的影響,不僅會(huì)改變納米粒子的表面形態(tài)及官能團(tuán),改變其理化性質(zhì),還會(huì)影響納米粒子在生物環(huán)境中的功能作用,進(jìn)而影響其安全性。探究蛋白質(zhì)與納米粒子之間的相互作用機(jī)制有助于理解蛋白冠的形成,為納米粒子的生物學(xué)評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。

2.2 蛋白冠對(duì)所吸附蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響

納米粒子與蛋白質(zhì)形成蛋白冠會(huì)引起所吸附蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化,改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,影響蛋白質(zhì)的生理功能,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生一系列變化。Liu等[45]和Cong等[46]發(fā)現(xiàn)從烤魷魚和烤鴨肉中提取的FNP改變了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例,并且隨著FNP濃度的增加,HSA的α-螺旋含量逐漸降低。Podila等[47]發(fā)現(xiàn)單碳壁納米管在與BSA相互作用后,BSA的電荷發(fā)生轉(zhuǎn)變。直接附著在納米粒子表面的蛋白質(zhì)比外層蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化更明顯[48],相對(duì)于吸附較小納米粒子的蛋白質(zhì),吸附在較大納米粒子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化也更明顯[49]。尺寸效應(yīng)進(jìn)一步導(dǎo)致納米粒子與蛋白質(zhì)之間的表面積和體積比發(fā)生變化,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)構(gòu)象。蛋白冠中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。Chakraborti等[50]發(fā)現(xiàn)球形蛋清溶菌酶與納米ZnO復(fù)合后,α-螺旋含量增加,酶活性下降了10%。Song等[51]從烤鮭魚中提取的FNP與胃蛋白酶和胰蛋白酶結(jié)合,可以改變這2種蛋白的構(gòu)象和酶活性。Wang等[52]發(fā)現(xiàn)SiO2納米粒子與枯草桿菌蛋白酶之間的非共價(jià)相互作用導(dǎo)致酶的構(gòu)象和活性發(fā)生變化。SiO2納米粒子吸附溶菌酶的活性損失程度與α-螺旋含量的下降程度密切相關(guān)[53]。由此可見蛋白冠會(huì)對(duì)所吸附蛋白產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)變化影響,其潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)值得我們關(guān)注。

2.3 蛋白冠對(duì)細(xì)胞內(nèi)化納米粒子的影響

大部分蛋白冠的存在可以降低細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取效率和內(nèi)化效率。Lesniak等[23]發(fā)現(xiàn),SiO2納米粒子與HSA形成蛋白冠后,其內(nèi)化效率降低和胞內(nèi)定位受到影響;在含血清的培養(yǎng)條件下,SiO2納米粒子主要存在于細(xì)胞內(nèi)囊泡中,而在無血清培養(yǎng)條件下,胞漿中納米粒子則較多。目前關(guān)于蛋白冠能減少納米粒子細(xì)胞內(nèi)化的原因還沒有統(tǒng)一的定論。細(xì)胞攝取效率取決于納米粒子對(duì)細(xì)胞膜的親和力[54]。Lesniak等[55]認(rèn)為蛋白冠的重要作用之一是可以減少納米材料表面與細(xì)胞膜之間的非特異性相互作用,從而減少細(xì)胞內(nèi)化。納米粒子的理化性質(zhì)和培養(yǎng)環(huán)境都影響其細(xì)胞內(nèi)化。一方面,納米粒子的大小和形狀會(huì)影響納米粒子形成蛋白冠后進(jìn)入細(xì)胞的方式。例如,Cheng等[56]發(fā)現(xiàn)在有血清培養(yǎng)的情況下,5～20 nm的Au納米粒子主要通過小窩蛋白途徑內(nèi)化到細(xì)胞,50 nm 的Au納米粒子則以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用為主要方式。熒光顯微鏡和TEM顯示,黑磷納米棒和黑磷量子點(diǎn)分別與人血漿蛋白形成蛋白冠后,形成蛋白冠的黑磷納米棒更容易被細(xì)胞吸附和內(nèi)化,但卻減少了細(xì)胞對(duì)黑磷量子點(diǎn)的內(nèi)化[57](圖2)。另一方面,納米粒子和蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)會(huì)抑制吸附作用。納米粒子表面具有較強(qiáng)疏水性的化學(xué)基團(tuán)會(huì)使納米粒子與蛋白質(zhì)的結(jié)合更緊密,從而抑制細(xì)胞對(duì)納米粒子的吸收。例如,糖基化蛋白可以減緩細(xì)胞膜對(duì)納米粒子的吸附,降低細(xì)胞攝取效率[58]。

圖2 不同納米粒子形成蛋白冠后在細(xì)胞內(nèi)的定位情況[57]Fig.2 Intracellular localization of different nanoparticles after protein corona formation[57]A. 黑磷量子點(diǎn)(BPQD)和黑磷納米片(BPNS)形成蛋白冠后通過熒光顯微鏡觀察在dTHP-1細(xì)胞定位情況,其中細(xì)胞核染成藍(lán)色,溶酶體染成紅色,蛋白冠染成綠色。標(biāo)尺為10 μm。B. 黑磷納米片和黑磷量子點(diǎn)形成蛋白冠后通過TEM觀察在dTHP-1細(xì)胞中的定位情況。標(biāo)尺為2 μm。A. Black phosphorus quantum dots(BPQD)and black phosphorus nanosheets(BPNS)formed protein corona and observed cell localization in dTHP-1 cells by fluorescence microscope,the nucleus was stained blue,the lysosome was stained red,and the protein corona was stained green. Scale bar:10 μm. B. After BPNS and BPQD formed protein corona,the cell localization in dTHP-1 cells was observed by TEM. Scale bar:2 μm.

在其他情況下,蛋白冠的存在雖然改變了納米粒子的理化性質(zhì),但是卻沒有降低納米粒子的攝取,反而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)納米粒子的吸附及內(nèi)化。Shaw等[59]發(fā)現(xiàn),在支氣管肺泡液系中形成的蛋白冠使巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的吸收增加2～5倍。di Silvio等[60]發(fā)現(xiàn)在食物基質(zhì)存在的情況下,由消化液形成的蛋白冠可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)鐵磁納米粒子的吸收,導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)變化。Barbalinardo等[61]報(bào)道,Ag納米粒子可與人淋巴細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈相互作用,只有預(yù)先形成蛋白冠的納米粒子才能被NIH-3T3細(xì)胞內(nèi)化,從而發(fā)揮其固有的細(xì)胞毒性。雖然更高的細(xì)胞攝取并不意味著更高的細(xì)胞毒性,但其潛在的影響不應(yīng)被忽視。

2.4 蛋白冠對(duì)納米粒子細(xì)胞毒性的影響

已有研究表明,蛋白冠可在一定程度上降低納米粒子的細(xì)胞毒性。Chong等[62]通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞染色觀察發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯和碳納米管與BSA形成蛋白冠后,減輕了對(duì)A549細(xì)胞的毒性。Chandran等[63]發(fā)現(xiàn)Au納米粒子在與人血漿形成蛋白冠后可以減少對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性,形成的蛋白冠是通過調(diào)節(jié)DNA的損傷與修復(fù)、熱休克反應(yīng)、線粒體能量代謝、氧化應(yīng)激等反應(yīng)減輕了Au納米粒子的毒性。Tan等[64]發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中溶酶體組織蛋白酶B呈斑點(diǎn),而在聚苯乙烯納米粒子處理的細(xì)胞中,組織蛋白酶B在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中彌漫性染色(圖3),表明組織蛋白酶B滲漏并增加了溶酶體膜的通透性;當(dāng)暴露于聚苯乙烯納米粒子和BSA形成的蛋白冠時(shí),這種效應(yīng)被顯著抑制。這些例子都證實(shí)了蛋白冠對(duì)細(xì)胞毒性具有抑制作用。

圖3 聚苯乙烯納米粒子形成蛋白冠前、后的細(xì)胞毒性[64]Fig.3 Cytotoxicity of polystyrene nanoparticles before and after formation of protein corona[64]細(xì)胞中組織蛋白酶B在聚苯乙烯納米粒子和在聚苯乙烯納米粒子和BSA形成的蛋白冠孵育24 h后的釋放情況。組織蛋白酶B被染成綠色,細(xì)胞核被染藍(lán)色。標(biāo)尺為10 μm。The release of cathepsin B in cells with polystyrene nanoparticles and the protein corona formed by polystyrene nanoparticles and BSA after 24 h. Cathepsin B was stained green and the nucleus was stained blue. Scale bar:10 μm.

造成細(xì)胞毒性的一個(gè)主要原因是納米粒子的表面與細(xì)胞膜接觸,使細(xì)胞膜發(fā)生不可逆的改變,造成細(xì)胞損傷和死亡[65]。蛋白冠可以減少納米粒子與細(xì)胞膜的直接接觸,保護(hù)細(xì)胞免受膜損傷。Song等[66]發(fā)現(xiàn)烤鮭魚的FNP與HSA形成蛋白冠后,可以顯著降低正常大鼠腎臟細(xì)胞的糖酵解代謝,細(xì)胞線粒體產(chǎn)生ATP的能力受損時(shí),細(xì)胞必須增加糖酵解活性以維持能量供應(yīng),證明蛋白冠可以使氧化磷酸化水平恢復(fù)。Liu等[67]發(fā)現(xiàn),HSA在烤牛肉FNP上形成的蛋白冠可以緩解正常大鼠腎細(xì)胞內(nèi)溶酶體的腫脹,抑制裸露FNP引起的線粒體膜電位的降低和ROS的升高。對(duì)于FNP和大部分納米粒子來說,在形成蛋白冠后能夠明顯減少細(xì)胞內(nèi)化作用和降低原有的毒性,這對(duì)避免其潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。

在一些情況下,蛋白冠的存在會(huì)增強(qiáng)納米粒子對(duì)細(xì)胞的毒性。納米粒子與蛋白質(zhì)結(jié)合后,蛋白質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生新的位點(diǎn),原有的構(gòu)象發(fā)生變化和暴露,蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變,從而增強(qiáng)納米粒子的細(xì)胞毒性。例如Yang等[68]發(fā)現(xiàn)吸附在Au納米粒子上的HSA發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,內(nèi)化后破壞細(xì)胞膜,細(xì)胞膜的乳酸脫氫酶含量顯著增加,從而增強(qiáng)了納米粒子的細(xì)胞毒性。Marucco等[69]發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原的吸附顯著增強(qiáng)了SiO2納米粒子和TiO2納米粒子誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的毒性,導(dǎo)致乳酸脫氫酶含量增加,進(jìn)而導(dǎo)致一氧化氮合酶和細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加[70],從而進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性。目前,FNP對(duì)蛋白冠作用于細(xì)胞通路的機(jī)制研究還不充分,需要進(jìn)一步深入研究。

2.5 蛋白冠對(duì)納米粒子細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響

納米粒子誘導(dǎo)的免疫毒性變化可能是由蛋白冠中蛋白質(zhì)的功能引起的。蛋白冠停留在生物環(huán)境中時(shí),納米粒子上的蛋白質(zhì)可能引起免疫反應(yīng)。納米粒子的類別和蛋白冠中蛋白質(zhì)的多樣性也可能干擾細(xì)胞的防御機(jī)制。Baimanov等[71]將MoS2納米片和蛋白冠復(fù)合物與巨噬細(xì)胞一起孵育并探究其促炎作用,結(jié)果表明巨噬細(xì)胞對(duì)形成蛋白冠的復(fù)合物更加敏感,并表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌能力。NF-κB信號(hào)通路在促炎作用的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。蛋白冠復(fù)合物暴露于脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞后,NF-κB磷酸化水平較對(duì)照組和MoS2納米片組有明顯升高,說明蛋白冠使NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)。蛋白冠的形成對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響是復(fù)雜的,其程度和結(jié)果可能與免疫反應(yīng)有關(guān),需要進(jìn)一步研究。這說明同樣作為食品添加劑和熱加工中產(chǎn)生的FNP進(jìn)入人體引起的一些免疫反應(yīng)可能與蛋白冠上的蛋白質(zhì)有關(guān),未來需要更多的試驗(yàn)來論證。

3 結(jié)論與展望

蛋白冠的存在對(duì)FNP在人體健康中的作用有重要的影響。蛋白冠能夠改變FNP的體內(nèi)運(yùn)動(dòng)行為和生物效應(yīng)。但目前,蛋白冠的研究大多集中在體外研究,不能完全反映蛋白冠的體內(nèi)影響?？紤]到FNP上蛋白冠的復(fù)雜性,需要更系統(tǒng)地開展工作。首先,我們需要確認(rèn)哪些蛋白質(zhì)更容易與納米粒子相結(jié)合,以及蛋白冠在生理環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化過程,以闡明蛋白冠形成的機(jī)制。其次,在體內(nèi)和體外探究FNP上蛋白冠的具體行為還存在困難,特別是蛋白質(zhì)與FNP之間的相互作用。

綜上所述,FNP在人體中的代謝過程以及蛋白冠可能產(chǎn)生的影響與FNP安全性密切相關(guān)。蛋白冠對(duì)FNP的表面性質(zhì)、體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性的影響是不同的,取決于所處條件的相互作用。蛋白冠中蛋白質(zhì)的多樣性及其結(jié)構(gòu)變化也可能引起細(xì)胞通路反應(yīng)和免疫反應(yīng)。目前人們對(duì)FNP形成的蛋白冠的認(rèn)識(shí)仍處于初級(jí)階段,需要了解這些自然修飾的FNP在生理系統(tǒng)中的作用,以減少潛在的危害。