• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究土茯苓抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制

    2022-10-04 13:50:42高詩堯章鎮(zhèn)宇李育泉黃林科
    巴楚醫(yī)學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:土茯苓成骨成骨細(xì)胞

    高詩堯 寧 超 章鎮(zhèn)宇 李育泉 黃林科 譚 楨

    (1. 廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530022; 2. 廣西醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 骨科, 廣西 南寧 530007)

    骨質(zhì)疏松是一種多因素導(dǎo)致的骨骼疾病,其主要特征為骨組織中骨小梁的破壞,導(dǎo)致骨量下降,骨強(qiáng)度降低,骨脆性增加[1-2]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率隨著年齡增長逐漸增高[3],我國65歲以上人群中骨質(zhì)疏松患病率已達(dá)32%[4]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前主要認(rèn)為是由于骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破所導(dǎo)致[5]。因此,進(jìn)一步了解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制,研究防治骨質(zhì)疏松的方法是目前醫(yī)學(xué)上亟待解決的問題。

    土茯苓是一味傳統(tǒng)中藥,在臨床上廣泛使用。研究表明,土茯苓可以治療痛風(fēng)[6]、皮膚病[7]等疾病。然而,土茯苓成分復(fù)雜多樣,目前關(guān)于該藥治療骨質(zhì)疏松的化學(xué)成分和作用機(jī)制研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門借助多種學(xué)科技術(shù),如系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)、分子藥理學(xué)及藥動(dòng)學(xué)等,從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用的新學(xué)科[8]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)土茯苓治療骨質(zhì)疏松的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理,并通過全面系統(tǒng)生物學(xué)分析,深入揭示土茯苓成分-靶點(diǎn)-通路之間的相互作用,并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證土茯苓對(duì)成骨的作用,為探索土茯苓治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞

    武漢普諾賽生命科技有限公司提供MC3T3-E1成骨細(xì)胞系。

    1.1.2 藥品與試劑

    土茯苓購自上海源葉生物科技有限公司,成骨誘導(dǎo)液(β-磷酸甘油0.4 mol,抗壞血酸10 mg/mL,地塞米松100 μmol)由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司提供,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 土茯苓藥物成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)搜集

    將土茯苓在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[9]中篩選出藥物的有效成分,同時(shí)按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18篩選出有效成分并搜集其相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.2.2 骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)的建立

    在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞搜集疾病靶點(diǎn),刪除重復(fù)靶點(diǎn)并利用Unitprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白與基因的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換。

    1.2.3 構(gòu)建韋恩圖、有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    通過微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)在線作圖工具制作韋恩圖并獲得藥物-疾病交集靶點(diǎn),采用Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建藥物有效成分與基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

    1.2.4 構(gòu)建藥物蛋白與疾病蛋白的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

    采用STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://string-db.org)[10]對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,隱藏游離節(jié)點(diǎn),獲取TSV數(shù)據(jù),使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,根據(jù)CytoHubba插件的MCC算法獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中的前十位核心靶點(diǎn)基因。

    1.2.5 GO和KEGG富集分析

    使用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)[11]對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,設(shè)富集結(jié)果P<0.01時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用微生信在線作圖軟件對(duì)富集結(jié)果-log10(Pvalue)值由小到大排列的GO生物功能前10條及KEGG信號(hào)通路前20條富集結(jié)果制作氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

    1.2.6 土茯苓對(duì)成骨分化的影響

    MC3T3-E1成骨細(xì)胞系復(fù)蘇后接種于α-MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    土茯苓完全溶解于含有二甲亞砜的母液中,-20℃下保存。使用前用完全培養(yǎng)基將其溶解于所需的工作液中。將MC3T3-E1細(xì)胞以105/孔接種于24孔板??瞻讓?duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入含有誘導(dǎo)液(每50 mL的培養(yǎng)基加入1.25 mL β-磷酸甘油,0.25 mL抗壞血酸,5 μL地塞米松)和不同濃度土茯苓(0 μmol/L,10 μmol/L,50 μmol/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。間隔48 h更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)7天后用多聚甲醛固定30 min,ALP顯色試劑盒染色30 min。采用BioTek成像系統(tǒng)拍照, Image J軟件定量分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 土茯苓藥物成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)

    根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn),在TCMSP數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn)檢索,共獲得土茯苓有效成分15個(gè)(表1),其中包括槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等;成分相關(guān)靶點(diǎn)總計(jì)324個(gè),刪除重復(fù)靶點(diǎn),最終有129個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

    表1 土茯苓有效成分一覽表

    2.2 骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點(diǎn)

    在GeneCards數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn)檢索,共獲得疾病靶點(diǎn)4 658個(gè),取Relevance score分?jǐn)?shù)≥0.5的2 287個(gè)靶點(diǎn)。

    2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)、有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

    構(gòu)建藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖(見圖1),獲得PTGS1、PGR、JUN、ESR1、AKT1及MAPK3等68個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn);通過Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行映射分析,構(gòu)建土茯苓有效成分相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。

    圖1 土茯苓-骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)及交集韋恩圖

    注:紅色代表土茯苓的有效成分,藍(lán)色代表有效成分的靶點(diǎn)基因

    2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

    在STRING軟件中,對(duì)68個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析,獲取TSV數(shù)據(jù)文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行分析,使用插件CytoHubba中MCC算法獲取藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)中前10的核心基因,包括IL1B、PTGS2、TNF、CXCL8、VEGFA、IL10、EGF、JUN、CCL2、AKT1。對(duì)核心基因進(jìn)行PPI分析,見圖3。

    注:A:土茯苓與骨質(zhì)疏松癥共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,顏色由淺入深按照degree從小到大排列; B:土茯苓治療骨質(zhì)疏松癥前十位核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,顏色深淺代表靶點(diǎn)蛋白的重要性

    2.5 GO及KEGG富集分析

    將土茯苓治療骨質(zhì)疏松癥的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析,其中GO富集分析主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、核受體活性等;KEGG通路富集分析結(jié)果顯示基因可能涉及HIF-1、AMPK、P53及Wnt信號(hào)通路。通過微生信在線作圖軟件對(duì)富集結(jié)果-log10(Pvalue)值由小到大排列,GO生物功能前10條(圖4A)及由大到小排列KEGG信號(hào)通路前20條富集結(jié)果制作氣泡圖(圖4B)。

    注:BP:生物學(xué)過程; CC:細(xì)胞組分; MF:分子功能

    2.6 土茯苓對(duì)成骨分化的影響

    為了解土茯苓對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用,我們對(duì)成骨細(xì)胞系MC3T3-E1加入誘導(dǎo)液和不同濃度土茯苓(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)并設(shè)置空白對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)7天后,進(jìn)行ALP染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,僅加入誘導(dǎo)液的對(duì)照組ALP染色呈陰性,隨著加入土茯苓的濃度增加,ALP染色加深,50 μmol/L的土茯苓可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)(P<0.01),見圖5。

    注:與空白組比較,**P<0.01; 與誘導(dǎo)液+0 μmol/L土茯苓組相比,##P<0.01

    3 討論

    骨質(zhì)疏松由于進(jìn)行性骨量減少及骨強(qiáng)度降低,骨小梁破壞,增加了骨折風(fēng)險(xiǎn)。該病主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性腰背部疼痛、平衡功能降低[12]。骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)基礎(chǔ)在于成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收功能失衡[13]。各種原因?qū)е碌某晒羌?xì)胞的減少而影響骨形成減弱是其重要的發(fā)病機(jī)制[14]。成骨在細(xì)胞基質(zhì)礦化中發(fā)揮重要作用,成骨細(xì)胞的減少導(dǎo)致骨形成減少[4]。目前,臨床治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物有維生素D、甲狀旁腺激素和雙膦酸鹽等[15]。而這些藥物具有一定副作用,如雌激素療法并不適合長期治療骨質(zhì)疏松癥,主要由于高水平的雌激素可能誘發(fā)子宮出血、乳腺癌和心血管疾病[16];雙膦酸鹽可能引起惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)[17]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從網(wǎng)絡(luò)層面觀察藥物對(duì)疾病的影響并闡明機(jī)制,從而有效降低用藥風(fēng)險(xiǎn)并找出高效藥物。目前有研究已證實(shí),中草藥及提取物在骨質(zhì)疏松防治方面安全有效,如虎杖苷可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,增強(qiáng)骨質(zhì)疏松癥期間骨髓間質(zhì)干細(xì)胞功能,減輕骨質(zhì)流失[18]。

    本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出OB≥30%和DL≥0.18的15個(gè)土茯苓有效成分,發(fā)現(xiàn)作用于骨質(zhì)疏松靶基因的主要活性成分有柚皮素[19]、槲皮素[20]、β-谷甾醇[21],這些化合物主要參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT相關(guān)信號(hào)通路等。除此之外,存在一些尚未被研究的有效成分,這將成為未來研究土茯苓治療骨質(zhì)疏松的潛在方向。土茯苓的活性成分與骨質(zhì)疏松的主要蛋白有很強(qiáng)的相互作用,其中涉及JUN、TNF、VEGFA等核心靶蛋白。研究證實(shí),在骨形成中基因VEGF發(fā)揮不可替代的作用,與骨修復(fù)關(guān)系是不可分割的,其主要機(jī)制是可以誘導(dǎo)新血管生成,從而為骨組織提供氧氣、營養(yǎng)、生長因子和激素,促進(jìn)骨組織的生長[22]。JUN磷酸化后,可以通過刺激cAMP信號(hào)通路,促使類固醇生成的相關(guān)基因表達(dá)量增加[23]。TNF通過直接刺激細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化[24]。故推測(cè),土茯苓可能通過作用于VEGFA、JUN、TNF等靶點(diǎn)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

    我們將所得到的靶點(diǎn)通過KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)可能通過HIF-1、AMPK、Wnt等多條通路參與防治骨質(zhì)疏松。研究表明,Wnt通路可以促進(jìn)成骨的分化,其主要機(jī)制如下:當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活狀態(tài)時(shí),Wnt蛋白與卷曲蛋白及低密度脂蛋白相互結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GSK-3β進(jìn)而降解復(fù)合物[25];β-catenin由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核,其C端與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合,上調(diào)RUNX2/Cbfα轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá),從而促進(jìn)成骨分化[26]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)ALP染色也發(fā)現(xiàn),土茯苓具有促進(jìn)成骨分化的作用。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)、骨形成不可缺少的因子,可以直觀反映骨的活躍程度[27]。

    綜上所述,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),土茯苓防治骨質(zhì)疏松可能與其能夠促進(jìn)成骨分化有關(guān),為下一步系統(tǒng)地開展土茯治療骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    土茯苓成骨成骨細(xì)胞
    經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與牙周膜干細(xì)胞成骨分化
    土茯苓的臨床應(yīng)用及其用量探究
    川芎土茯苓魚湯緩解頭痛
    特別健康(2018年2期)2018-06-29 06:13:50
    糖尿病大鼠Nfic與成骨相關(guān)基因表達(dá)的研究
    淫羊藿次苷Ⅱ通過p38MAPK調(diào)控成骨細(xì)胞護(hù)骨素表達(dá)的體外研究
    方草尋源——土茯苓
    土茯苓葉和種子的抗氧化活性研究
    土家傳統(tǒng)藥刺老苞總皂苷對(duì)2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷改善
    液晶/聚氨酯復(fù)合基底影響rBMSCs成骨分化的研究
    30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折術(shù)后康復(fù)護(hù)理
    91麻豆av在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲av第一区精品v没综合| 满18在线观看网站| 欧美激情高清一区二区三区| 又大又爽又粗| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产成人啪精品午夜网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费 | avwww免费| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 超色免费av| 首页视频小说图片口味搜索| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一二三四在线观看免费中文在| 麻豆成人av在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 老汉色∧v一级毛片| 国产不卡av网站在线观看| 国产免费现黄频在线看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄片播放在线免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产主播在线观看一区二区| 91av网站免费观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品一区二区在线不卡| 欧美人与性动交α欧美软件| 老熟妇仑乱视频hdxx| 啦啦啦免费观看视频1| 男女床上黄色一级片免费看| 69av精品久久久久久| 两人在一起打扑克的视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av天堂在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 精品久久久久久电影网| 精品国产国语对白av| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲第一青青草原| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久视频综合| 伦理电影免费视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品福利永久在线观看| 三级毛片av免费| 黑人猛操日本美女一级片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲全国av大片| 在线观看一区二区三区激情| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 后天国语完整版免费观看| 大码成人一级视频| 成人精品一区二区免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 深夜精品福利| 满18在线观看网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产成人啪精品午夜网站| 美女福利国产在线| 看免费av毛片| 一级片'在线观看视频| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品二区激情视频| 国产精品国产av在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看午夜福利视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产乱人伦免费视频| 在线国产一区二区在线| 国产一区二区三区视频了| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲熟妇熟女久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 69精品国产乱码久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 麻豆国产av国片精品| av片东京热男人的天堂| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 看免费av毛片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美成人午夜精品| 久久久久久人人人人人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲精品一二三| 99re6热这里在线精品视频| 国产午夜精品久久久久久| 五月开心婷婷网| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费不卡黄色视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 最新美女视频免费是黄的| 国产成人免费无遮挡视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产高清videossex| 一级作爱视频免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 视频区图区小说| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲黑人精品在线| 两性夫妻黄色片| 超色免费av| 中文欧美无线码| 亚洲精华国产精华精| 丝袜人妻中文字幕| 电影成人av| 18在线观看网站| 亚洲免费av在线视频| 在线av久久热| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 99热网站在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产成人影院久久av| 亚洲精华国产精华精| 视频在线观看一区二区三区| 久99久视频精品免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久国产成人精品二区 | cao死你这个sao货| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 在线观看午夜福利视频| 国产97色在线日韩免费| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久九九热精品免费| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美国产精品一级二级三级| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲一区二区三区不卡视频| 曰老女人黄片| 天堂俺去俺来也www色官网| 黄色 视频免费看| 免费看a级黄色片| 好男人电影高清在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久久久久久久久久大奶| 热99re8久久精品国产| 人人澡人人妻人| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产视频一区二区在线看| 久久久国产欧美日韩av| 丰满的人妻完整版| 久久香蕉国产精品| 久久久久久久精品吃奶| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久精品亚洲av国产电影网| 视频区图区小说| 777米奇影视久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久青草综合色| 欧美激情久久久久久爽电影 | 9热在线视频观看99| 黄色 视频免费看| 国产xxxxx性猛交| 黄片小视频在线播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 欧美中文综合在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 99热只有精品国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线观看免费视频日本深夜| 韩国精品一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲av美国av| 精品国产乱码久久久久久男人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜精品在线福利| 成人国语在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产99久久九九免费精品| 久久久久久久久免费视频了| 丝袜美足系列| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 悠悠久久av| 国产在线一区二区三区精| 精品一区二区三卡| e午夜精品久久久久久久| 久久久国产一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 久热爱精品视频在线9| 嫩草影视91久久| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日本一区二区免费在线视频| 亚洲美女黄片视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲色图综合在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲欧美一区二区三区久久| 少妇 在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜福利一区二区在线看| 成年人免费黄色播放视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 免费高清在线观看日韩| 久9热在线精品视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕 | 精品国内亚洲2022精品成人 | 中文字幕最新亚洲高清| 怎么达到女性高潮| 国产精品免费视频内射| 999精品在线视频| 午夜福利视频在线观看免费| 波多野结衣av一区二区av| 国产野战对白在线观看| 午夜福利,免费看| 女人久久www免费人成看片| 母亲3免费完整高清在线观看| 久99久视频精品免费| 午夜久久久在线观看| 午夜久久久在线观看| 我的亚洲天堂| 成人影院久久| 亚洲熟女毛片儿| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品影院久久| 国产欧美亚洲国产| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看日韩欧美| 9色porny在线观看| 亚洲国产欧美网| 久久久久久久国产电影| 国产精品国产av在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av片天天在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 精品人妻在线不人妻| 成人免费观看视频高清| 老鸭窝网址在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 超色免费av| 欧美大码av| netflix在线观看网站| 无限看片的www在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线观看日韩欧美| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久 成人 亚洲| 欧美精品亚洲一区二区| 99久久人妻综合| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 十八禁人妻一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品1区2区在线观看. | 免费在线观看影片大全网站| 超碰97精品在线观看| 亚洲全国av大片| 国产xxxxx性猛交| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜久久久在线观看| 成年人黄色毛片网站| 视频区图区小说| 高清在线国产一区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久精品久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产三级黄色录像| 一进一出抽搐动态| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清 | 色婷婷av一区二区三区视频| 在线观看舔阴道视频| 国产真人三级小视频在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美黄色淫秽网站| 国产1区2区3区精品| 午夜福利影视在线免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 天天影视国产精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产男女内射视频| 真人做人爱边吃奶动态| 激情视频va一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美成人午夜精品| 免费在线观看影片大全网站| av天堂在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品一品国产午夜福利视频| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩福利视频一区二区| 丁香六月欧美| 久热爱精品视频在线9| 国产成人系列免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 中亚洲国语对白在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜精品国产一区二区电影| 丰满的人妻完整版| 精品免费久久久久久久清纯 | 无限看片的www在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久精品国产清高在天天线| а√天堂www在线а√下载 | 免费日韩欧美在线观看| 飞空精品影院首页| 黄色女人牲交| 免费人成视频x8x8入口观看| 成人黄色视频免费在线看| 中出人妻视频一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 男女床上黄色一级片免费看| 天堂√8在线中文| a在线观看视频网站| www.精华液| 91在线观看av| 免费在线观看影片大全网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 99久久99久久久精品蜜桃| 国产又色又爽无遮挡免费看| av福利片在线| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜在线中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 十分钟在线观看高清视频www| 91九色精品人成在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av熟女| 久久影院123| 国产视频一区二区在线看| 99国产综合亚洲精品| aaaaa片日本免费| 国产成人av激情在线播放| 老司机亚洲免费影院| 一a级毛片在线观看| 国产成人影院久久av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品电影一区二区在线| 精品人妻在线不人妻| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男人舔女人的私密视频| 国产三级黄色录像| 少妇的丰满在线观看| 欧美日韩av久久| 国产男女超爽视频在线观看| 老司机福利观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产片内射在线| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲中文av在线| 欧美精品av麻豆av| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久中文字幕一级| 91国产中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本一区二区免费在线视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品高清国产在线一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人av教育| www日本在线高清视频| 99re在线观看精品视频| 久久亚洲真实| 国产精品免费大片| 午夜激情av网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品国产一区二区久久| 满18在线观看网站| 91大片在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产片内射在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美色视频一区免费| 国产人伦9x9x在线观看| 国产99白浆流出| 黄片小视频在线播放| 欧美日韩一级在线毛片| 老司机亚洲免费影院| 另类亚洲欧美激情| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一个人免费在线观看的高清视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 水蜜桃什么品种好| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 午夜精品久久久久久毛片777| bbb黄色大片| 欧美乱色亚洲激情| 在线天堂中文资源库| 国产精品亚洲av一区麻豆| 激情视频va一区二区三区| 五月开心婷婷网| 免费不卡黄色视频| 一级a爱视频在线免费观看| 十八禁网站免费在线| 波多野结衣一区麻豆| 久久 成人 亚洲| 热99久久久久精品小说推荐| tocl精华| 色综合婷婷激情| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 视频区图区小说| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 欧美乱妇无乱码| 成年人午夜在线观看视频| 久久天堂一区二区三区四区| 久久性视频一级片| 午夜日韩欧美国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品无人区乱码1区二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜福利,免费看| av网站在线播放免费| 亚洲三区欧美一区| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 久久亚洲真实| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产高清激情床上av| 香蕉国产在线看| 国产99久久九九免费精品| 欧美 日韩 精品 国产| www日本在线高清视频| av线在线观看网站| 午夜福利在线免费观看网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 搡老乐熟女国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 一区在线观看完整版| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品无人区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品久久视频播放| a级毛片黄视频| 国产成人精品久久二区二区91| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久中文字幕一级| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 男男h啪啪无遮挡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 脱女人内裤的视频| 男女床上黄色一级片免费看| 两个人看的免费小视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品永久免费网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 不卡一级毛片| 亚洲 国产 在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 另类亚洲欧美激情| 在线免费观看的www视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产91精品成人一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 热re99久久国产66热| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲avbb在线观看| 欧美色视频一区免费| 久久性视频一级片| 亚洲七黄色美女视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产一区有黄有色的免费视频| 乱人伦中国视频| 亚洲第一青青草原| 久久久久精品人妻al黑| 久久草成人影院| av电影中文网址| 午夜影院日韩av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美日韩成人在线一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品人妻在线不人妻| 久久久久久久精品吃奶| 欧美黄色淫秽网站| 搡老乐熟女国产| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美不卡视频在线免费观看 | 天堂中文最新版在线下载| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品第一国产精品| 在线观看66精品国产| 精品视频人人做人人爽| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 国精品久久久久久国模美| 999精品在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 久久国产精品大桥未久av| 99riav亚洲国产免费| 精品无人区乱码1区二区| 在线观看免费高清a一片| 亚洲美女黄片视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 桃红色精品国产亚洲av| 免费在线观看日本一区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美色视频一区免费| 男男h啪啪无遮挡| 在线天堂中文资源库| 成人特级黄色片久久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲男人天堂网一区| 久久性视频一级片| 女人被狂操c到高潮| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 脱女人内裤的视频| 手机成人av网站| 午夜视频精品福利| 欧美日本中文国产一区发布| 嫁个100分男人电影在线观看| 成年人黄色毛片网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 黑人猛操日本美女一级片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 中文字幕制服av| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 操出白浆在线播放| 一级片'在线观看视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产免费男女视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 一级毛片高清免费大全| av中文乱码字幕在线| а√天堂www在线а√下载 | 午夜福利在线观看吧| 国精品久久久久久国模美| 国产成人系列免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久久人人人人人| 五月开心婷婷网| 国产精品免费大片| 飞空精品影院首页| 亚洲国产欧美一区二区综合| 咕卡用的链子| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看免费高清a一片| 欧美激情 高清一区二区三区| 777米奇影视久久|