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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究土茯苓抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制

    2022-10-04 13:50:42高詩堯章鎮(zhèn)宇李育泉黃林科
    巴楚醫(yī)學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:土茯苓成骨成骨細(xì)胞

    高詩堯 寧 超 章鎮(zhèn)宇 李育泉 黃林科 譚 楨

    (1. 廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530022; 2. 廣西醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 骨科, 廣西 南寧 530007)

    骨質(zhì)疏松是一種多因素導(dǎo)致的骨骼疾病,其主要特征為骨組織中骨小梁的破壞,導(dǎo)致骨量下降,骨強(qiáng)度降低,骨脆性增加[1-2]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率隨著年齡增長逐漸增高[3],我國65歲以上人群中骨質(zhì)疏松患病率已達(dá)32%[4]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前主要認(rèn)為是由于骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破所導(dǎo)致[5]。因此,進(jìn)一步了解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制,研究防治骨質(zhì)疏松的方法是目前醫(yī)學(xué)上亟待解決的問題。

    土茯苓是一味傳統(tǒng)中藥,在臨床上廣泛使用。研究表明,土茯苓可以治療痛風(fēng)[6]、皮膚病[7]等疾病。然而,土茯苓成分復(fù)雜多樣,目前關(guān)于該藥治療骨質(zhì)疏松的化學(xué)成分和作用機(jī)制研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門借助多種學(xué)科技術(shù),如系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)、分子藥理學(xué)及藥動(dòng)學(xué)等,從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用的新學(xué)科[8]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)土茯苓治療骨質(zhì)疏松的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理,并通過全面系統(tǒng)生物學(xué)分析,深入揭示土茯苓成分-靶點(diǎn)-通路之間的相互作用,并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證土茯苓對(duì)成骨的作用,為探索土茯苓治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞

    武漢普諾賽生命科技有限公司提供MC3T3-E1成骨細(xì)胞系。

    1.1.2 藥品與試劑

    土茯苓購自上海源葉生物科技有限公司,成骨誘導(dǎo)液(β-磷酸甘油0.4 mol,抗壞血酸10 mg/mL,地塞米松100 μmol)由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司提供,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 土茯苓藥物成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)搜集

    將土茯苓在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[9]中篩選出藥物的有效成分,同時(shí)按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18篩選出有效成分并搜集其相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.2.2 骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)的建立

    在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞搜集疾病靶點(diǎn),刪除重復(fù)靶點(diǎn)并利用Unitprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白與基因的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換。

    1.2.3 構(gòu)建韋恩圖、有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    通過微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)在線作圖工具制作韋恩圖并獲得藥物-疾病交集靶點(diǎn),采用Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建藥物有效成分與基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

    1.2.4 構(gòu)建藥物蛋白與疾病蛋白的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

    采用STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://string-db.org)[10]對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,隱藏游離節(jié)點(diǎn),獲取TSV數(shù)據(jù),使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,根據(jù)CytoHubba插件的MCC算法獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中的前十位核心靶點(diǎn)基因。

    1.2.5 GO和KEGG富集分析

    使用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)[11]對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,設(shè)富集結(jié)果P<0.01時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用微生信在線作圖軟件對(duì)富集結(jié)果-log10(Pvalue)值由小到大排列的GO生物功能前10條及KEGG信號(hào)通路前20條富集結(jié)果制作氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

    1.2.6 土茯苓對(duì)成骨分化的影響

    MC3T3-E1成骨細(xì)胞系復(fù)蘇后接種于α-MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    土茯苓完全溶解于含有二甲亞砜的母液中,-20℃下保存。使用前用完全培養(yǎng)基將其溶解于所需的工作液中。將MC3T3-E1細(xì)胞以105/孔接種于24孔板??瞻讓?duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組加入含有誘導(dǎo)液(每50 mL的培養(yǎng)基加入1.25 mL β-磷酸甘油,0.25 mL抗壞血酸,5 μL地塞米松)和不同濃度土茯苓(0 μmol/L,10 μmol/L,50 μmol/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。間隔48 h更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)7天后用多聚甲醛固定30 min,ALP顯色試劑盒染色30 min。采用BioTek成像系統(tǒng)拍照, Image J軟件定量分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 土茯苓藥物成分及成分相關(guān)靶點(diǎn)

    根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn),在TCMSP數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn)檢索,共獲得土茯苓有效成分15個(gè)(表1),其中包括槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等;成分相關(guān)靶點(diǎn)總計(jì)324個(gè),刪除重復(fù)靶點(diǎn),最終有129個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

    表1 土茯苓有效成分一覽表

    2.2 骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點(diǎn)

    在GeneCards數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn)檢索,共獲得疾病靶點(diǎn)4 658個(gè),取Relevance score分?jǐn)?shù)≥0.5的2 287個(gè)靶點(diǎn)。

    2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)、有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

    構(gòu)建藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖(見圖1),獲得PTGS1、PGR、JUN、ESR1、AKT1及MAPK3等68個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn);通過Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行映射分析,構(gòu)建土茯苓有效成分相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。

    圖1 土茯苓-骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)及交集韋恩圖

    注:紅色代表土茯苓的有效成分,藍(lán)色代表有效成分的靶點(diǎn)基因

    2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

    在STRING軟件中,對(duì)68個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析,獲取TSV數(shù)據(jù)文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行分析,使用插件CytoHubba中MCC算法獲取藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)中前10的核心基因,包括IL1B、PTGS2、TNF、CXCL8、VEGFA、IL10、EGF、JUN、CCL2、AKT1。對(duì)核心基因進(jìn)行PPI分析,見圖3。

    注:A:土茯苓與骨質(zhì)疏松癥共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,顏色由淺入深按照degree從小到大排列; B:土茯苓治療骨質(zhì)疏松癥前十位核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,顏色深淺代表靶點(diǎn)蛋白的重要性

    2.5 GO及KEGG富集分析

    將土茯苓治療骨質(zhì)疏松癥的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析,其中GO富集分析主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、核受體活性等;KEGG通路富集分析結(jié)果顯示基因可能涉及HIF-1、AMPK、P53及Wnt信號(hào)通路。通過微生信在線作圖軟件對(duì)富集結(jié)果-log10(Pvalue)值由小到大排列,GO生物功能前10條(圖4A)及由大到小排列KEGG信號(hào)通路前20條富集結(jié)果制作氣泡圖(圖4B)。

    注:BP:生物學(xué)過程; CC:細(xì)胞組分; MF:分子功能

    2.6 土茯苓對(duì)成骨分化的影響

    為了解土茯苓對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用,我們對(duì)成骨細(xì)胞系MC3T3-E1加入誘導(dǎo)液和不同濃度土茯苓(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)并設(shè)置空白對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)7天后,進(jìn)行ALP染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,僅加入誘導(dǎo)液的對(duì)照組ALP染色呈陰性,隨著加入土茯苓的濃度增加,ALP染色加深,50 μmol/L的土茯苓可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)(P<0.01),見圖5。

    注:與空白組比較,**P<0.01; 與誘導(dǎo)液+0 μmol/L土茯苓組相比,##P<0.01

    3 討論

    骨質(zhì)疏松由于進(jìn)行性骨量減少及骨強(qiáng)度降低,骨小梁破壞,增加了骨折風(fēng)險(xiǎn)。該病主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性腰背部疼痛、平衡功能降低[12]。骨質(zhì)疏松的病理生理學(xué)基礎(chǔ)在于成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收功能失衡[13]。各種原因?qū)е碌某晒羌?xì)胞的減少而影響骨形成減弱是其重要的發(fā)病機(jī)制[14]。成骨在細(xì)胞基質(zhì)礦化中發(fā)揮重要作用,成骨細(xì)胞的減少導(dǎo)致骨形成減少[4]。目前,臨床治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物有維生素D、甲狀旁腺激素和雙膦酸鹽等[15]。而這些藥物具有一定副作用,如雌激素療法并不適合長期治療骨質(zhì)疏松癥,主要由于高水平的雌激素可能誘發(fā)子宮出血、乳腺癌和心血管疾病[16];雙膦酸鹽可能引起惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)[17]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從網(wǎng)絡(luò)層面觀察藥物對(duì)疾病的影響并闡明機(jī)制,從而有效降低用藥風(fēng)險(xiǎn)并找出高效藥物。目前有研究已證實(shí),中草藥及提取物在骨質(zhì)疏松防治方面安全有效,如虎杖苷可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,增強(qiáng)骨質(zhì)疏松癥期間骨髓間質(zhì)干細(xì)胞功能,減輕骨質(zhì)流失[18]。

    本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出OB≥30%和DL≥0.18的15個(gè)土茯苓有效成分,發(fā)現(xiàn)作用于骨質(zhì)疏松靶基因的主要活性成分有柚皮素[19]、槲皮素[20]、β-谷甾醇[21],這些化合物主要參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT相關(guān)信號(hào)通路等。除此之外,存在一些尚未被研究的有效成分,這將成為未來研究土茯苓治療骨質(zhì)疏松的潛在方向。土茯苓的活性成分與骨質(zhì)疏松的主要蛋白有很強(qiáng)的相互作用,其中涉及JUN、TNF、VEGFA等核心靶蛋白。研究證實(shí),在骨形成中基因VEGF發(fā)揮不可替代的作用,與骨修復(fù)關(guān)系是不可分割的,其主要機(jī)制是可以誘導(dǎo)新血管生成,從而為骨組織提供氧氣、營養(yǎng)、生長因子和激素,促進(jìn)骨組織的生長[22]。JUN磷酸化后,可以通過刺激cAMP信號(hào)通路,促使類固醇生成的相關(guān)基因表達(dá)量增加[23]。TNF通過直接刺激細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化[24]。故推測(cè),土茯苓可能通過作用于VEGFA、JUN、TNF等靶點(diǎn)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

    我們將所得到的靶點(diǎn)通過KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)可能通過HIF-1、AMPK、Wnt等多條通路參與防治骨質(zhì)疏松。研究表明,Wnt通路可以促進(jìn)成骨的分化,其主要機(jī)制如下:當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活狀態(tài)時(shí),Wnt蛋白與卷曲蛋白及低密度脂蛋白相互結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GSK-3β進(jìn)而降解復(fù)合物[25];β-catenin由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核,其C端與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合,上調(diào)RUNX2/Cbfα轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá),從而促進(jìn)成骨分化[26]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)ALP染色也發(fā)現(xiàn),土茯苓具有促進(jìn)成骨分化的作用。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)、骨形成不可缺少的因子,可以直觀反映骨的活躍程度[27]。

    綜上所述,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),土茯苓防治骨質(zhì)疏松可能與其能夠促進(jìn)成骨分化有關(guān),為下一步系統(tǒng)地開展土茯治療骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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