黃酒低聚糖的分離純化與體外菌群增殖評(píng)價(jià)

馮欣靜，周志磊,3，姬中偉,3，楊懿，徐岳正，毛健,*

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，浙江 紹興，312000)4(國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興，312000)

黃酒具有口感醇厚、香氣馥郁等特色，深受我國消費(fèi)者的青睞。多樣的釀造原料、復(fù)雜的釀造工藝及多菌種共酵體系賦予了黃酒豐富的功能性成分，主要包括多糖、低聚糖、蛋白質(zhì)、多肽、游離氨基酸、有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)[1]，其中糖類物質(zhì)占比最高。黃酒中糖類物質(zhì)主要包括葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、黃酒低聚糖與黃酒多糖等[2]。低聚糖已被報(bào)道可有效促進(jìn)腸道益生菌的增殖[3]，但黃酒低聚糖能否發(fā)揮此種功效尚未可知。黃酒低聚糖是由2～10個(gè)單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚合度糖，主要來源于原料稻米與小麥中淀粉的酶解、小麥麩皮酶解、微生物自身代謝等[4]。黃酒中低聚糖含量豐富，低聚異麥芽糖是黃酒低聚糖的主要成分[4]。BAI等[5]利用高效液相色譜法對黃酒中低聚異麥芽糖進(jìn)行定量檢測，測得黃酒中低聚異麥芽糖含量多集中于7～8 g/L。然而，尚未有人對黃酒中低聚糖進(jìn)行分離純化及功能研究。

研究發(fā)現(xiàn)膳食低聚糖具有增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、上調(diào)機(jī)體有益代謝產(chǎn)物含量及增加腸內(nèi)有益菌群豐度等功能[6]。黃酒低聚糖難以被胃和小腸酶解，大多數(shù)可到達(dá)結(jié)腸內(nèi)被結(jié)腸微生物發(fā)酵利用[4]。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)為結(jié)腸微生物酵解難消化碳水化合物的代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、調(diào)節(jié)pH促進(jìn)有益菌增殖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功效[7]。黃酒低聚糖是否可通過對腸道菌群的有益調(diào)節(jié)發(fā)揮益生功效仍有待探討。

本研究選取市場主流的半干型黃酒為原料，通過黃酒原液濃縮、乙醇醇沉、旋蒸除乙醇、Sevage法除蛋白、旋蒸除Sevage試劑、3 000 Da與300 Da膜分離、冷凍干燥技術(shù)等步驟對黃酒低聚糖進(jìn)行分離，同時(shí)通過DEAE Sepharose Fast Flow與Sephadex G15對黃酒低聚糖進(jìn)行純化。低聚果糖是廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的功能性低聚糖[3]，而葡萄糖可作為菌群發(fā)酵的共同碳源被腸道菌群利用[8]。因此本研究通過小鼠腸道菌群體外發(fā)酵研究比較了葡萄糖(陰性對照組)、低聚果糖(陽性對照組)與黃酒低聚糖的體外益生效果，為黃酒低聚糖后續(xù)功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究所用半干型黃酒樣品，中國紹興某公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DEAE Sepharose Fast Flow、Sephadex G15，北京索萊寶科技有限公司；低聚果糖，上海麥克林生化科技有限公司；BBL、LBS、BDS、EMB培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸，上海阿拉丁有限公司；系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司；半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，美國Sigma-Aldrich公司；其余試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，杭州庚雨儀器有限公司；卷式膜納濾設(shè)備，紹興海納膜技術(shù)有限公司；ME204號(hào)立式大容量多管離心機(jī)、Trace 1300 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；752N紫外可見光分光光度計(jì)，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；Beta 1-8實(shí)驗(yàn)室型凍干機(jī)，北京博勱行儀器有限公司；HYG-B全溫?fù)u瓶柜，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SKD-1800全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；AW 200 SG厭氧工作站，瑞士康科技有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters 1525 EF高效液相色譜儀，美國沃特世公司；ICS 5000離子色譜儀，美國戴安公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)樣品

1.3.1.1 黃酒原液濃縮與分級(jí)醇沉

黃酒低聚糖的分離純化步驟如圖1所示。首先利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于55 ℃將黃酒原液以9∶1的體積比減壓濃縮。向濃縮物中添加無水乙醇至體系內(nèi)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)75%，充分?jǐn)嚢韬笥? ℃冰箱靜置過夜，24 h后離心收集合并沉淀，并于-20 ℃冰箱保存。

圖1 黃酒低聚糖分離純化流程圖

1.3.1.2 Sevage法除黃酒蛋白

將所得沉淀以去離子水溶解后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋蒸除去體系內(nèi)殘留乙醇。將溶液與Sevage試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]在搖瓶中以5∶1體積比混合，置于全溫?fù)u瓶柜內(nèi)充分混勻。2 h后將混合液于立式大容量多管離心機(jī)中離心(4 000 r/min，8 min)，此時(shí)變性蛋白聚集于有機(jī)試劑與水層分界處。收集上層糖液重復(fù)上述操作，直至分層處基本無蛋白沉淀。收集合并上層糖液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋蒸除去體系內(nèi)有機(jī)試劑，上清液保存于-20 ℃。

1.3.1.3 膜分離收集黃酒低聚糖

參考CAI等[9]的研究方式對黃酒低聚糖進(jìn)行截留，并進(jìn)行適量修改。將除蛋白后的黃酒糖液置于卷式膜納濾設(shè)備中，以3 000 Da聚醚砜超濾膜進(jìn)行截留。隨后向膜過濾機(jī)中添加足量去離子水，直至體系內(nèi)低聚糖充分過濾。收集濾出液，保存于-20 ℃冰箱。隨后以300 Da聚酰胺納濾膜對上述濾出液進(jìn)行截留，向膜過濾機(jī)中添加足量去離子水，收集截留液保存于-20 ℃冰箱。將糖液置于-80 ℃冰箱中過夜冷凍后，于冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，得到淡黃色粗黃酒低聚糖粉。

1.3.1.4 黃酒低聚糖提取率與回收率的測定

按1.3.1.3將黃酒原液分別以3 000 Da超濾膜與300 Da納濾膜過濾后，測定300～3 000 Da截留范圍內(nèi)黃酒液中總糖含量與還原糖含量。測得各步驟所得糖液中總糖(苯酚硫酸法[9])與還原糖(DNS法[9])含量，黃酒低聚糖提取率與回收率,如公式(1)～公式(3)所示：

m1=m2-m3

(1)

(2)

(3)

式中：m1為黃酒低聚糖總含量；m2為黃酒截留液總糖含量；m3為黃酒截留液還原糖含量；m4為各步驟糖液總糖含量；m5為各步驟糖液還原糖含量；m6為各步驟糖液低聚糖總量。

1.3.2 黃酒低聚糖的純化

1.3.2.1 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析純化

參考沈赤[10]的研究方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。采用離子交換柱層析技術(shù)分離攜帶不同電荷的黃酒低聚糖。玻璃層析柱內(nèi)徑2 cm，柱高80 cm，上樣體積5 mL，上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL。將DEAE Sepharose Fast Flow填料緩慢傾倒入層析柱內(nèi)，沖洗平衡后分別以去離子水、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，各洗脫液均洗脫20管。調(diào)節(jié)恒流泵流速至2 mL/min，每5 min收集1管樣品，以苯酚硫酸法逐管檢測收集管內(nèi)糖含量。

1.3.2.2 Sephadex G15葡聚糖凝膠柱純化

參考易曉敏等[11]的研究方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。利用Sephadex G15對DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱分離后的低聚糖組分進(jìn)行二次純化。將該組分配制為10 mg/mL的溶液，上樣體積5 mL，以去離子水為洗脫液進(jìn)行洗脫，同時(shí)用自動(dòng)部分收集器逐管進(jìn)行收集。調(diào)節(jié)恒流泵流速至0.5 mL/min，每10 min 收集一管樣品，以苯酚硫酸法逐管檢測收集管內(nèi)糖含量。

1.3.2.3 黃酒低聚糖分子質(zhì)量分布

配制5 mg/mL的黃酒低聚糖溶液，糖液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后注入液相小瓶中待測，以Waters 1525色譜儀進(jìn)行分子質(zhì)量測定。分別稱取重均分子質(zhì)量為180、342、505、1 200、3 650 Da的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品并配制為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以色譜峰的保留時(shí)間(Rt)為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgMw)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到黃酒低聚糖分子質(zhì)量。洗脫程序參考了劉衛(wèi)寶[12]的研究方法。

1.3.2.4 黃酒低聚糖的單糖組成

利用ICS 5000離子色譜儀對黃酒低聚糖的單糖組成進(jìn)行分析，預(yù)處理與洗脫方法參考了劉衛(wèi)寶[12]的研究，并進(jìn)行適當(dāng)修改。配制包括鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸在內(nèi)的5 mg/L的低質(zhì)量濃度混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與200 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。高濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品用于測定黃酒低聚糖中葡萄糖的摩爾比，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于測定黃酒低聚糖中其余單糖的含量。

1.3.3 黃酒低聚糖對腸道菌群體外增殖評(píng)價(jià)

1.3.3.1 小鼠糞便勻漿的配制

新鮮的小鼠糞便從江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獲得，小鼠此前未進(jìn)行過抗生素治療。以無菌糞便收集盒收集小鼠糞便，立即用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L)轉(zhuǎn)移至厭氧操作箱內(nèi)。小鼠糞便與PBS緩沖液以1∶10(g∶mL)比例配制。經(jīng)渦旋振蕩器充分混勻后，以3層無菌紗布混合過濾得到糞便勻漿用于接種[13]。

1.3.3.2 體外發(fā)酵方法

小鼠糞便菌群的發(fā)酵方式參考鄭志昌等[8]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。糞便培養(yǎng)基的配制參考王如月[13]的研究方案。分別以葡萄糖、低聚果糖與黃酒低聚糖(純化后)充當(dāng)碳源物質(zhì)，培養(yǎng)基在115 ℃下滅菌30 min。以葡萄糖組為陰性對照組，低聚果糖組為陽性對照組，黃酒低聚糖組為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。體外發(fā)酵在無菌三角瓶中進(jìn)行，每瓶分裝入30 mL培養(yǎng)基。糞便菌液以10%(體積分?jǐn)?shù))接入，并置于厭氧工作站37 ℃下恒溫培養(yǎng)。在孵育前，以無菌注射器從管內(nèi)吸取1.5 mL培養(yǎng)基進(jìn)行指標(biāo)測定，隨后在發(fā)酵4、8、12、24、36、48 h時(shí)以相同的方式獲得隨后的等分試樣，并保存在-80 ℃直至分析。各分組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.3 發(fā)酵液OD600值的測定

參考李娟[14]的方法對發(fā)酵液OD600值進(jìn)行測定，并進(jìn)行適當(dāng)修改。1 mL發(fā)酵液于4 ℃下12 000 r/min離心5 min，分別收集上清液與菌體。向菌泥管中加入1 mL無菌水后渦旋混勻，隨后置于酶標(biāo)儀測定OD600值以表征菌體生長情況。

1.3.3.4 發(fā)酵液pH值的測定

收集各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液后迅速浸入冰水以停止發(fā)酵。隨后以精密pH計(jì)測定1.3.3.3所得上清液的pH值。

1.3.3.5 發(fā)酵液糖余量測定

各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液的糖余量以苯酚硫酸法進(jìn)行測定[9]。

1.3.3.6 發(fā)酵液SCFAs含量測定

取1 mL發(fā)酵上清液進(jìn)行SCFAs的提取。以乙醚萃取發(fā)酵液中SCFAs，經(jīng)無水Na2SO4除水后，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后注入液相小瓶中待測。預(yù)處理與上機(jī)條件參考了WANG等[15]的研究方法。

1.3.3.7 黃酒低聚糖對小鼠腸道特定菌群生長情況的影響

按說明書要求對雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌與大腸桿菌檢測培養(yǎng)基進(jìn)行配制，隨后于121 ℃下滅菌20 min備用。取不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液并以生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取合適稀釋度的100 μL稀釋液均勻涂布于不同的選擇培養(yǎng)基上[16]。將平板置于厭氧工作站37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

本研究各實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。多重比較之間的差異采用單因素方差分析和Fisher′s LSD檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒低聚糖提取率

通過苯酚硫酸法及DNS法測得黃酒原液中低聚糖含量為(13.88±0.02)g/L。各步驟黃酒低聚糖提取率及回收率如表1所示。經(jīng)圖1系列步驟操作后，黃酒低聚糖提取率達(dá)(31.80±0.89)%，黃酒低聚糖回收率為72.49%～86.44%。在醇沉階段，部分低聚糖仍溶于上清液中，未能完全被乙醇沉淀；在Sevage試劑除蛋白階段，有機(jī)相與水相分層處的糖液未能完全收集，存在一定損失；超濾與納濾階段的損失主要?dú)w因于卷式膜過濾機(jī)內(nèi)部及濾膜內(nèi)殘存部分低聚糖；低聚糖凍干粉的質(zhì)量略低于過膜后所測糖液質(zhì)量，原因可能是部分糖粉殘留于凍干盤難以徹底刮凈。

表1 黃酒低聚糖的提取率及回收率

2.2 黃酒低聚糖的純化

2.2.1 DEAE Sepharose Fast Flow分離純化黃酒低聚糖

采用DEAE Sepharose Fast Flow對黃酒低聚糖溶液進(jìn)行分離純化。如圖2-a所示，粗黃酒低聚糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow層析柱洗脫后可得4種不同低聚糖組分(Huangjiu oligosaccharides，HJO)HJO-1，HJO-2，HJO-3與HJO-4。其中HJO-1含量占比(76.19±0.90)%，HJO-2含量占比(7.63±0.58)%，HJO-3含量占比(5.85±0.37)%，HJO-4含量占比(10.33±0.68)%?？紤]到收集時(shí)間成本與脫鹽成本，本實(shí)驗(yàn)選用HJO-1進(jìn)行后續(xù)分離純化，測得HJO-1的提取率達(dá)(66.23±1.03)%。

2.2.2 Sephadex G15分離純化黃酒低聚糖

利用Sephadex G15對HJO-1組分進(jìn)行后續(xù)分離純化。如圖2-b所示，本次洗脫共洗脫出兩種低聚糖HJO-a與HJO-b。其中HJO-a含量占比為(94.40±0.70)%，HJO-b含量占比為(5.60±0.16)%。考慮到收集時(shí)間成本，本研究多次收集HJO-a進(jìn)行冷凍干燥，并測得HJO-a的提取率為(82.10±4.18)%。將提取到的HJO-a用于體外菌群增殖實(shí)驗(yàn)。

a-DEAE Sepharose Fast Flow；b-Sephadex G15

2.2.3 黃酒低聚糖的分子質(zhì)量分布與單糖組成

由圖3-a可知，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱純化出的HJO-a均一性良好，峰形單一且對稱。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到其重均分子質(zhì)量為1 002 Da；由圖3-b可知，黃酒低聚糖HJO-a主要由葡萄糖(81.74%)、阿拉伯糖(6.13%)、甘露糖(5.51%)、木糖(4.92%)與半乳糖(1.70%)等5種單糖組成，其百分摩爾比已在文中標(biāo)出。

a-分子質(zhì)量；b-單糖組成

2.3 黃酒低聚糖對腸道菌群體外增殖評(píng)價(jià)

2.3.1 黃酒低聚糖的組成

測得黃酒低聚糖糖粉中低聚糖含量為(84.21±0.16)%，還原糖含量為(4.76±0.17)%，蛋白質(zhì)(凱氏定氮法[9])含量為(6.51±0.14)%，水分(《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》GB 5009.3—2016)含量為(3.13±0.04)%。

2.3.2 發(fā)酵液pH值的變化

pH值是反映糖類物質(zhì)在酵解過程中被人體腸道菌群利用程度的重要指標(biāo)[13]，益生元可通過降低腸道pH值來抑制病原菌的繁殖[17]。如圖4-a所示，對照組、低聚果糖組與黃酒低聚糖組發(fā)酵液的pH值均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而降低。其中以低聚果糖為碳源的發(fā)酵液pH下降最快，黃酒低聚糖組次之，而對照組下降最慢。前12 h發(fā)酵液pH變化較大，這表明菌群生長較為旺盛。24～48 h發(fā)酵液pH幅度較小，這表明菌群代謝較慢或基本停滯。低聚糖已被報(bào)道可促進(jìn)腸道內(nèi)乳桿菌與雙歧桿菌等益生菌的增殖[4]。添加低聚果糖與黃酒低聚糖的發(fā)酵液pH下降較快的原因可能是定向促進(jìn)了腸內(nèi)雙歧桿菌等益生菌的增殖，進(jìn)而增加乳酸與SCFAs的含量，最終實(shí)現(xiàn)pH的快速降低。與低聚果糖相比，黃酒低聚糖組發(fā)酵液pH下降較慢，這可能是由于黃酒低聚糖的平均聚合度比低聚果糖稍大。

2.3.3 發(fā)酵液菌群密度的變化

OD600值可反映菌體密度，表征小鼠腸道菌群在不同碳源培養(yǎng)基中的生長情況[8]。如圖4-b所示，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，對照組、低聚果糖組與黃酒低聚糖組的菌體密度均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增加。與低聚果糖和黃酒低聚糖組相比，前4 h對照組菌群增長速率較高，這可能是由于葡萄糖為單糖，易于被腸道菌群優(yōu)先利用。與葡萄糖相比，低聚果糖與黃酒低聚糖聚合度相對較高，需被腸道菌群逐步酵解后再利用，因此在前4 h低聚果糖與黃酒低聚糖菌群密度較對照組低。在4～24 h內(nèi)，黃酒低聚糖與低聚果糖的菌群密度高于對照組，這表明低聚糖逐步被腸道菌群降解，隨后用于菌群生長繁殖。在24～48 h內(nèi)，菌群代謝緩慢，這可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)基本耗盡，菌群生長進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.3.4 發(fā)酵液糖余量的變化

腸道菌群對不同碳源的消耗速率存在差異[8]。如圖4-c所示，隨發(fā)酵時(shí)間增加，對照組、低聚果糖組與黃酒低聚糖組的總糖余量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸降低。相比于低聚果糖組與黃酒低聚糖組，在前4 h腸道菌群對葡萄糖的消耗速率更快，這與圖4-b菌群生長曲線一致。在4～24 h，各組總糖余量相差不大，這表明黃酒低聚糖與低聚果糖被腸道菌群酵解后利用。除聚合度的影響外，糖的組成種類、單糖組成、鏈連接方式等因素也對糖消耗速率存在影響，如蕎麥蜂花粉多糖在酵解24 h后可基本被消耗[14]，在相同時(shí)間下車前子多糖僅能酵解47.2%，豌豆纖維僅能酵解20%[14]。

a-pH；b-OD600值；c-總糖余量

2.3.5 發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液SCFAs的變化

較低的pH會(huì)影響腸道菌群的組成，進(jìn)而影響SCFAs的產(chǎn)生。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對發(fā)酵液中SCFAs含量進(jìn)行測定。如圖5所示，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸與異丁酸含量均表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢。在發(fā)酵過程，黃酒低聚糖組在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)乙酸與丁酸的含量均顯著高于對照組(圖5-a、圖5-c，P<0.05)；除4 h與8 h，黃酒低聚糖組在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)丙酸的含量均顯著高于對照組(圖5-b，P<0.05)，這可能是由于部分丙酸被腸道菌群利用所致；此外，除4 h時(shí)間點(diǎn)，黃酒低聚糖組在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)異丁酸的含量均顯著高于對照組(圖5-d，P<0.05)，這可能是由于黃酒低聚糖聚合度較高，發(fā)酵速率較慢所致。在發(fā)酵過程中，低聚果糖組發(fā)酵液中乙酸與丙酸含量略高于黃酒低聚糖組，而黃酒低聚糖組丁酸與異丁酸含量則稍高于低聚果糖組。

a-乙酸；b-丙酸；c-丁酸；d-異丁酸

SCFAs是腸道微生物酵解難消化的碳水化合物的主要產(chǎn)物[18]，在降低腸道pH值、調(diào)節(jié)宿主代謝、細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。此外，SCFAs 可被宿主吸收，被認(rèn)為是宿主腸道的重要能量來源[14]。據(jù)報(bào)道，喂食含低聚半乳糖的豬飼料可顯著提高豬回腸中SCFAs含量[19]，并增加糞便中雙歧桿菌與乳桿菌的含量；殼寡糖干預(yù)可增加便秘小鼠腸道SCFAs含量，并增加腸道乳桿菌與擬桿菌等菌屬的豐度[20]。因此，可推測黃酒低聚糖對SCFAs的增加可能對機(jī)體表現(xiàn)出一定的益生作用。

2.3.6 發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液特定菌群數(shù)量的變化

為探究黃酒低聚糖的益生特性，本研究對不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌與大腸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測，如表2所示。

表2 不同碳源對發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液特定菌群數(shù)量的變化 單位：lgCFU/mL

與對照組相比，黃酒低聚糖與低聚果糖顯著增加了不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳桿菌與擬桿菌的數(shù)量(P<0.05)，同時(shí)顯著降低了大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，黃酒低聚糖與低聚果糖效果相近，這表明黃酒低聚糖可發(fā)揮類似的益生作用。

在人體腸道菌群中，雙歧桿菌、乳桿菌與擬桿菌為重要的腸道益生菌[8,10]。腸道雙歧桿菌可參與機(jī)體多種消化酶、氨基酸、SCFAs與維生素的合成，進(jìn)而發(fā)揮抗衰老、抗腫瘤、減輕腸道炎癥等功效[21]。此外，雙歧桿菌還可抑制致病菌的增殖及毒素的侵襲[16]；乳桿菌可發(fā)揮代謝產(chǎn)SCFAs、降低膽固醇、促進(jìn)機(jī)體對礦物質(zhì)的吸收等功效，從而維持腸道微生態(tài)平衡[16,22]；擬桿菌是對人體有益的共生菌，已被證明可產(chǎn)生SCFAs，促進(jìn)機(jī)體吸收并增強(qiáng)機(jī)體免疫[16,23]；大腸桿菌為條件致病菌，一定條件下可誘發(fā)機(jī)體疾病，降低機(jī)體免疫力[10]。由此可推測，黃酒低聚糖對腸道菌群存在積極的調(diào)節(jié)作用，有望提取黃酒低聚糖作為膳食干預(yù)劑對腸道疾病進(jìn)行靶向治療。

3 結(jié)論

本研究首次對黃酒中低聚糖進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行體外菌群增殖評(píng)價(jià)，主要結(jié)論如下：

(1)本研究通過75%乙醇醇沉、Sevage法除蛋白及膜分離法從黃酒中提取黃酒低聚糖。經(jīng)瓊脂糖凝膠柱DEAE Sepharose Fast Flow及Sephadex G15分離純化后得到主要的黃酒低聚糖組分HJO-a，其純度可達(dá)(84.21±0.16)%；(2)與葡萄糖相比，以黃酒低聚糖為碳源的培養(yǎng)液可顯著增加發(fā)酵液中SCFAs的含量(P<0.05)，并有效促進(jìn)發(fā)酵液中腸道益生菌雙歧桿菌、乳桿菌與擬桿菌的增殖(P<0.05)，并顯著降低了條件致病菌大腸桿菌的含量(P<0.05)；(3)與低聚果糖相比，黃酒低聚糖對腸道菌群的增殖可發(fā)揮類似的調(diào)節(jié)作用，這揭示黃酒低聚糖可作為潛在的益生元被腸道菌群利用。