miR-4701-5p通過下調(diào)CXCR4及其相關(guān)YAP信號通路對腎癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

曾 光，胡曉暉，楊 超，杜 然

腎癌是一種起自腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。誘發(fā)腎癌的因素眾多，如吸煙、肥胖、高血壓等，腎癌的發(fā)病率近年來逐年上升[2]。絕大多數(shù)腎癌患者對化療和放療都不敏感，手術(shù)是腎癌的主要治療方式[3]。積極探索新的分子靶向治療藥物是改善腎癌患者預(yù)后的重要手段。隨著非編碼RNA研究的進(jìn)展，微小RNA(miRNA)被證實(shí)對各種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為都能產(chǎn)生抑制作用[4]。其中，miR-4701-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，由miR-4701剪切生成[5]。研究表明，miR-4701-5p在肺腺癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)，恢復(fù)miR-4701-5p表達(dá)能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，改善肺腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性，發(fā)揮明顯的腫瘤抑制作用[6]。miR-4701-5p在腎癌中的表達(dá)及對腎癌惡性表型的影響報(bào)道較少。本研究旨在探討腎癌組織和細(xì)胞株中miR-4701-5p的表達(dá)水平，觀察恢復(fù)miR-4701-5p表達(dá)對腎癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，并初步研究其機(jī)制，為臨床針對腎癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及試劑 人腎癌細(xì)胞株OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20及正常腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。LipofectamineTM2000試劑和TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司。miR-4701-5p mimic、mimic NC購自北京索萊寶公司。胎牛血清和高糖培養(yǎng)基均購自美國Thermo Scientific HyClone公司。趨化因子受體4(CXCR4) mRNA野生型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-WT)質(zhì)粒、CXCR4 mRNA突變型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-MUT)質(zhì)粒購自美國Promega公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃ 5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。傳代4～5次，取對數(shù)生長期SK-RC-20細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，將SK-RC-20細(xì)胞分為miR-4701-5p mimic組和mimic NC組，分別加入miR-4701-5p mimic、mimic NC，操作按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書執(zhí)行，常規(guī)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)檢測。

1.3miR-4701-5p表達(dá)分析和靶基因預(yù)測 通過TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析miR-4701-5p在腎癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平差異。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件miRGator對miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測。

1.4qPCR檢測細(xì)胞中miR-4701-5p和CXCR4 mRNA的表達(dá) 所有細(xì)胞均采用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)超微量核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。建立qPCR循環(huán)體系，qPCR引物序列：GAPDH上游：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游：GCGCCCAATACGACCAAATC；rRNA18S上游：ATTCCGATAACGAACGAGAC，下游：TCACAGACCTGTTATTGCTC；miR-4701-5p上游：ATGAGTTGGCCACCACACCTA，下游：TTGGCCACCACACCTACCCCTT；CXCR4上游：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，下游：CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-4701-5p和CXCR4 mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4701-5p與CXCR4的靶向關(guān)系 將SK-RC-20細(xì)胞分為CXCR4-WT組和CXCR4-MUT組，分別將miR-4701-5p mimic、mimic NC與構(gòu)建的CXCR4-WT和CXCR4-MUT熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，每組4個(gè)復(fù)孔。孵育48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測各組SK-RC-20細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.6集落形成實(shí)驗(yàn)法檢測SK-RC-20細(xì)胞的增殖能力 采用胰酶消化各轉(zhuǎn)染組SK-RC-20細(xì)胞，以2 ml細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)10 d后棄上清，采用2%多聚甲醛進(jìn)行固定，采用結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色。流水充分清洗后，室溫下風(fēng)干，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)每孔的集落形成數(shù)。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SK-RC-20細(xì)胞的遷移能力 采用胰酶消化各轉(zhuǎn)染組SK-RC-20細(xì)胞，以500 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于下室。培養(yǎng)箱孵育24 h，采用2%多聚甲醛進(jìn)行固定，采用Giemsa染液進(jìn)行染色，采用棉簽擦掉未穿過底膜的細(xì)胞。在40倍光學(xué)顯微鏡下選擇6個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8Western blotting檢測SK-RC-20細(xì)胞中CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白的表達(dá) 采用胰酶消化各轉(zhuǎn)染組SK-RC-20細(xì)胞，采用PBS清洗5次，用RIPA裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白，分別取60 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳以及硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜。于10%脫脂牛奶中封閉150 min，分別孵育一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4(濃度均為1∶1000)，加入1∶4000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，均勻孵育，化學(xué)發(fā)光顯色液，在暗室中曝光、顯影，β-Tubulin為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1miR-4701-5p在腎癌組織和腎癌細(xì)胞株中的表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，腎癌組織中miR-4701-5p的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1。qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-4701-5p在腎癌OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細(xì)胞株中的表達(dá)水平低于HK-2細(xì)胞，SK-RC-20細(xì)胞株中miR-4701-5p表達(dá)低于OS-RC-2、A498、ACHN細(xì)胞(P<0.05，P<0.01)，見圖2。故選擇SK-RC-20細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-4701-5p在腎癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

圖2 miR-4701-5p在腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.2miR-4701-5p過表達(dá)效率 轉(zhuǎn)染后，mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞中miR-4701-5p表達(dá)水平分別為1.03±0.47和11.02±1.72。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞中miR-4701-5p表達(dá)率高于mimic NC組(P<0.01)。

2.3miR-4701-5p過表達(dá)可抑制SK-RC-20細(xì)胞的增殖 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞集落形成數(shù)少于mimic NC組(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-4701-5p過表達(dá)對SK-RC-20細(xì)胞增殖的影響

2.4miR-4701-5p過表達(dá)可抑制SK-RC-20細(xì)胞的遷移 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)少于mimic NC組(P<0.05)，見圖4。

2.5miR-4701-5p靶向結(jié)合CXCR4 mRNA 通過生物信息學(xué)軟件miRGator預(yù)測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染CXCR4 mRNA野生型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞株中相對熒光素酶活性低于mimic NC組(P<0.01);共轉(zhuǎn)染CXCR4 mRNA突變型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞株中相對熒光素酶活性與mimic NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖5 miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關(guān)系CXCR4為趨化因子受體4

圖6 SK-RC-20細(xì)胞株中miR-4701-5p相對熒光素酶活性

2.6miR-4701-5p靶向抑制CXCR4 mRNA表達(dá) mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞株中CXCR4 mRNA表達(dá)水平分別為6.91±1.48和1.05±0.46。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞株中CXCR4 mRNA表達(dá)量低于mimic NC組(P<0.01)。

2.7CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白表達(dá) 與mimic NC組相比，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細(xì)胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白YAP、CTGF、ANKRD1表達(dá)水平均明顯降低。見圖7。

圖7 miR-4701-5p對SK-RC-20細(xì)胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來研究顯示，miRNA在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，已成為各種疾病治療研究的熱點(diǎn)[7-9]。miRNA在腎癌診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測方面可能具有應(yīng)用潛力[10-11]。HUANG等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在腎癌組織中表達(dá)上調(diào)，其在體外能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，敲除miR-140-5p可顯著抑制腎癌裸鼠模型的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。ZENG等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p在腎癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào)，miR-92a-3p過表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和集落形成，下調(diào)miR-92a-3p則抑制腎癌細(xì)胞增殖和集落形成。miR-4701-5p在多種疾病中起關(guān)鍵作用[6]。BI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4701-5p能夠顯著抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。LI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4701-5p在體外可降低慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對多種化療藥物的耐藥性，并且在小鼠體內(nèi)將腫瘤細(xì)胞從阿霉素耐藥轉(zhuǎn)化為易感細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，在腎癌組織和細(xì)胞株中miR-4701-5p表達(dá)水平分別低于癌旁組織和正常腎小管上皮細(xì)胞，提示miR-4701-5p可能發(fā)揮抑制腎癌進(jìn)展的作用。

本研究體外實(shí)驗(yàn)顯示，miR-4701-5p過表達(dá)能夠顯著降低SK-RC-20細(xì)胞的增殖水平和遷移能力。研究表明，miRNA通過靶向結(jié)合靶基因mRNA，下調(diào)靶基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型[15]。本研究通過生物信息學(xué)軟件miRGator預(yù)測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。CXCR4蛋白屬于具有化學(xué)趨化作用的細(xì)胞因子超家族成員，其基因定位在染色體2q21，大小為352個(gè)氨基酸[16]。CXCR4參與介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、免疫反應(yīng)、血管生成等各種病理和生理進(jìn)程[17]。CXCR4在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中高表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]。CXCR4在腎癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá)，能夠顯著增強(qiáng)腎癌786-O和769-P細(xì)胞的增殖和遷移[19]。本研究結(jié)果顯示，miR-4701-5p可以靶向結(jié)合并抑制CXCR4基因的表達(dá)，CXCR4是miR-4701-5p的靶基因。已有研究證實(shí)，CXCR4蛋白通過激活YAP信號通路，誘導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-4701-5p過表達(dá)顯著抑制YAP信號通路的激活，進(jìn)一步證實(shí)miR-4701-5p通過調(diào)節(jié)CXCR4基因表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-4701-5p在腎癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，miR-4701-5p過表達(dá)可以靶向抑制CXCR4基因表達(dá)，進(jìn)而抑制YAP信號通路的激活，減弱腎癌SK-RC-20細(xì)胞增殖和遷移。miR-4701-5p可能成為腎癌基因治療研究的新靶點(diǎn)。