結(jié)腸惡性病變患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)及與腫瘤相關(guān)基因、預(yù)后的關(guān)系

劉玉鳳，牛國超，鄭少華，趙 芝，張 剛，李哲麗

結(jié)腸癌為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來，隨著國民飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)改變和人口老齡化趨勢發(fā)展，該病發(fā)生率逐年增長[1-2]。結(jié)腸癌為臨床惡性程度較高的腫瘤疾病[3]，及時鑒別診斷，明確其基因?qū)W方面的發(fā)病原因是后續(xù)靶向治療的基礎(chǔ)。隨著RNA檢測技術(shù)的發(fā)展，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了多種非編碼RNA異常表達(dá)，并參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過結(jié)合mRNA的3' 非編碼區(qū)，影響靶基因表達(dá)，不僅可參與調(diào)控正常細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，還在腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮至關(guān)重要作用[6-7]。有學(xué)者指出，miR-31在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。LncRNA是一類具有多種調(diào)控功能的RNA分子，可作為分子海綿結(jié)合miRNA或染色質(zhì)修飾因子，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[9-10]。相關(guān)研究指出，MEG3在多種腫瘤細(xì)胞中扮演抑癌基因[11]?；诖?，本研究觀察結(jié)腸良惡性病變患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)情況，并分析其與腫瘤惡性程度的關(guān)系，旨在探索結(jié)腸癌發(fā)病機制，為結(jié)腸癌靶向治療及新藥研發(fā)提供思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2017年5月—2020年6月收治的行外科手術(shù)治療的結(jié)腸癌60例作為觀察組，其中男40例，女20例；年齡33～77(55.17±9.84)歲；病灶大?。?～9(4.58±0.49)cm；臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期34例，Ⅲ期11例；病理類型：黏液腺癌7例，管狀腺癌41例，印戒細(xì)胞癌8例，乳頭狀癌4例；部位：左半結(jié)腸27例，右半結(jié)腸26例，橫結(jié)腸7例。另選取同期收治結(jié)腸良性病變60例作為對照組，男42例，女18例；年齡34～78(56.24±11.78)歲；病灶大?。?～8(4.84±0.47)cm；病理類型：結(jié)腸息肉45例，結(jié)腸腺瘤15例；部位：左半結(jié)腸30例，右半結(jié)腸26例，橫結(jié)腸4例。2組性別、年齡及病灶大小等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實；術(shù)前未接受放化療及生物免疫治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌、結(jié)腸多原發(fā)癌或息肉、腺瘤樣結(jié)腸癌；伴有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等重要器官嚴(yán)重功能障礙者；合并Crohn's病、潰瘍性結(jié)腸炎等結(jié)腸疾病者；伴有其他惡性腫瘤者。

1.3方法

1.3.1LncRNA MEG3、miR-31檢測:分別取100 mg的凍存結(jié)腸癌組織、結(jié)腸良性病變組織置于研磨器中，加入1 ml Trizol試劑(上海澤葉生物科技有限公司)，將研磨器放置于液氮中將組織磨成粉末狀，裂解細(xì)胞并以等體積異丙醇(上海羽朵生物科技有限公司)沉淀后，提取RNA；75%乙醇(中國北京基尼亞生物技術(shù)有限公司)清洗RNA沉淀，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度及純度；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BIOMIGA公司)合成樣品cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用實時熒光定量PCR試劑盒(BIOMIGA公司)擴增LncRNA MEG3、miR-31基因，以β-actin作為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR，條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 共40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后，在計算機軟件中獲取相應(yīng)PCR擴增曲線，得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值；以2-ΔΔCt法分析，ΔΔCt=(樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值)-(對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示樣品中目的基因LncRNA MEG3、miR-31相對表達(dá)量。

1.3.2增殖、侵襲基因檢測:分別取結(jié)腸癌組織標(biāo)本，按照“1.3.1”相同步驟，檢測其增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)量。

1.3.3治療及預(yù)后：結(jié)腸癌患者均接受根治性手術(shù)治療，并進行為期1年隨訪，每3個月門診復(fù)查1次，隨訪終點為腫瘤復(fù)發(fā)，對于疑似復(fù)發(fā)患者實施穿刺活檢，確認(rèn)其是否復(fù)發(fā)。

1.4觀察指標(biāo) 比較2組LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)，評價LncRNA MEG3、miR-31對結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價值，分析結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與增殖基因、侵襲基因的相關(guān)性，并比較不同LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)的結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)情況。

2 結(jié)果

2.1LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)水平比較 觀察組LncRNA MEG3表達(dá)低于對照組，miR-31表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)水平比較

2.2LncRNA MEG3、miR-31對結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價值 以觀察組結(jié)腸癌患者為陽性樣本，對照組結(jié)腸良性病變患者為陰性樣本，繪制LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的ROC曲線，結(jié)果顯示LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的AUC分別為0.809、0.777，應(yīng)用Logistic二元回歸擬合，返回預(yù)測概率logit(p)，將其作為獨立檢驗變量，構(gòu)建各指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC為0.931，較上述單一指標(biāo)鑒別診斷價值更高。見表2、圖1。

表2 LncRNA MEG3、miR-31對結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價值

圖1 LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的ROC曲線

2.3結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3以截斷值9.00分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)水平均低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者癌組織LncRNA MEG3表達(dá)與hTERT、SphK1、LIMK1、PRDX1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.632、-0.607、-0.615、-0.674，P<0.01)。

表3 結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性

2.4結(jié)腸癌組織中miR-31表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者miR-31以截斷值0.99分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)腸癌組織中miR-31高表達(dá)組增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)水平均高于miR-31低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者癌組織miR-31表達(dá)與hTERT、SphK1、LIMK1、PRDX1呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.598、0.603、0.612、0.607，P<0.01)。

表4 結(jié)腸癌組織中miR-31表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性

2.5預(yù)后情況 結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31以截斷值分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為5.88%(1/17)低于LncRNA MEG3低表達(dá)組的23.26%(10/43)，miR-31高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為21.95%(9/41)高于miR-31低表達(dá)組的10.53%(2/19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)病過程是一個由多基因控制，分不同階段，長期形成的復(fù)雜致病過程[12]。miRNA是一類由18～23個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，主要功能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)以抑制翻譯和(或)促進miRNA降解，其可調(diào)控>30%的基因組，可參與細(xì)胞增殖、分化、代謝等過程[13-14]。迄今為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)500多個miRNA，均廣泛參與惡性腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖及凋亡等病理過程。近年來，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA存在于結(jié)腸癌中，并在其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，與結(jié)腸癌相關(guān)的miRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)，有研究指出，miR-31與結(jié)腸癌密切相關(guān)[15]。有學(xué)者指出，miR-31在結(jié)直腸癌中呈明顯高表達(dá)狀態(tài)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-31表達(dá)量高于淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者[16]。進一步研究顯示，轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑可顯著降低LoVo細(xì)胞內(nèi)miR-31表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂G2/M期停滯[17]。由此推測，miR-31可能是結(jié)腸癌患者的一個潛在早期診斷標(biāo)志物，且抑制其表達(dá)對結(jié)腸癌治療存在一定意義。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織miR-31表達(dá)高于結(jié)腸良性病變組織，提示miR-31可有效鑒別結(jié)腸良惡性病變，并可作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

LncRNA作為繼miRNA后發(fā)現(xiàn)的在人類疾病中發(fā)揮重要作用的非編碼RNA。近年來，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA在腫瘤發(fā)生、演變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18-19]。LncRNA可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后3個層面調(diào)控基因表達(dá)，其主要通過染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活或干擾等方式調(diào)控。MEG3作為小鼠母體印記基因GIt2的人類同系物，是首個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的LncRNA。MEG3在多種人類正常組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，尤其在腦及垂體中表達(dá)最高，但在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失或表達(dá)下降。已有研究證實，MEG3可通過促進細(xì)胞循環(huán)功能停滯，抑制癌細(xì)胞增殖及侵襲，并可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，阻礙腫瘤發(fā)生[20]。目前已有研究證實，MEG3可通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用，如DNA甲基化、Rb途徑、p53途徑及影響血管新生等[21-22]。司君利等[23]證實，MEG3在結(jié)腸癌中表達(dá)明顯下降，提示其在結(jié)腸癌中扮演著抑癌基因的角色，且相較于MEG3低表達(dá)者，高表達(dá)者中位生存期明顯延長，說明其對預(yù)測預(yù)后具有潛在價值。本研究中，觀察組LncRNA MEG3表達(dá)低于對照組，且其診斷結(jié)腸癌的AUC為0.809，具有一定診斷價值，與上述研究結(jié)果相符。

增殖基因異常表達(dá)直接參與結(jié)腸癌發(fā)生，而侵襲基因異常表達(dá)為腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，故檢測癌組織增殖基因與侵襲基因可反映腫瘤惡性程度。hTERT、SphK1為典型增殖基因，其中hTERT作為端粒酶催化亞基重要組成部分，可激活端粒酶，致腫瘤細(xì)胞無限增殖[24]；SphK1活化后可生成S1P，抑制其表達(dá)可促進細(xì)胞凋亡[25]。LIMK1、PRDX1為臨床常見侵襲基因，前者在腫瘤組織中呈高表達(dá)，主要通過調(diào)控去磷酸化平衡，促進腫瘤細(xì)胞侵襲；后者高表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞抗氧化能力增強，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，并促使其增殖、轉(zhuǎn)移[26-27]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3低表達(dá)組、miR-31高表達(dá)組hTERT、SphK1與LIMK1、PRDX1表達(dá)均高于LncRNA MEG3高表達(dá)組、miR-31低表達(dá)組，且相關(guān)性分析可知，LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)均與增殖基因、侵襲基因表達(dá)有明顯相關(guān)性，提示LncRNA MEG3低表達(dá)、miR-31高表達(dá)可直接促進結(jié)腸癌癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，臨床可通過檢測其表達(dá)，明確腫瘤惡性程度，為臨床診療提供依據(jù)。此外，本研究結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率低于LncRNA MEG3低表達(dá)組，miR-31高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高于miR-31低表達(dá)組，提示LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后有關(guān)，但本研究樣本量較小，且隨訪時間較短，有待臨床擴大樣本量，延長隨訪時間進一步證實。

綜上所述，結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3低表達(dá)、miR-31高表達(dá)，且二者表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān)，臨床檢測LncRNA MEG3、miR-31可用于鑒別診斷結(jié)腸良惡性腫瘤，明確腫瘤惡性程度，為臨床診斷及靶向治療、新藥研發(fā)提供思路。