益生菌輔助治療兒童難治性癲癇的臨床效果及對(duì)腸道微生態(tài)、炎性因子的影響

張金來，曹月榮，于 潔，張 倩，尹雪艷

癲癇是一種因腦神經(jīng)元迸發(fā)性異常放電，導(dǎo)致大腦出現(xiàn)一過性功能紊亂的慢性疾病[1]。據(jù)調(diào)研統(tǒng)計(jì)，我國(guó)癲癇患病率高達(dá)0.7%，且兒童為主要發(fā)病人群[2]，有65%～75%癲癇患兒經(jīng)過系統(tǒng)性的抗癲癇藥物治療，可獲得良好的臨床療效。然而，仍有30%～40%的癲癇患兒不能得到很好的控制，這些病例被認(rèn)為患有兒童難治性癲癇(CRE)[3-4]。癲癇具有短暫性及反復(fù)性2個(gè)基本特征，可一定程度的影響患兒腦部發(fā)育，嚴(yán)重者可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損，嚴(yán)重影響患兒健康成長(zhǎng)[5]。多項(xiàng)研究表明，免疫功能紊亂及炎性介質(zhì)釋放均可促進(jìn)CRE的發(fā)生及發(fā)展，因此有效調(diào)節(jié)患兒免疫功能，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)對(duì)治療本病具有積極的臨床意義[6-7]。近年發(fā)現(xiàn)益生菌也是抗癲癇的治療靶點(diǎn)之一。腸道菌群由致病菌、機(jī)會(huì)致病菌及益生菌組成，有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和乳酸代謝終末產(chǎn)物具有治療及預(yù)防腸道內(nèi)和腸道外來源疾病的作用，同時(shí)還具有抑制炎性因子釋放及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[8-9]。故此本研究將益生菌用于CRE的輔助治療，觀察其臨床療效及對(duì)腸道微生態(tài)、炎性因子、免疫因子的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年6月—2019年9月滄州市中心醫(yī)院收治的62例CRE進(jìn)行隨訪研究，其中男32例(51.61%)，女30例(48.39%)；年齡7個(gè)月～8歲(5.63±0.59)歲；每月癲癇發(fā)作頻次6～15(10.18±1.46)次。疾病分類：Dravet綜合征7例(11.29%)，Lennox-Gastaut綜合征3例(4.84%)，嬰兒痙攣癥22例(35.48%)，結(jié)節(jié)性硬化癥6例(9.68%)，全面性癲癇12例(19.35%)，部分局灶性癲癇7例(11.29%)，Ⅰ型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷癥5例(8.06%)。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《臨床診療指南：癲癇病分冊(cè)》[10]中CRE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用≥3種抗癲癇藥物治療后，每月癲癇發(fā)作頻率仍≥4次；年齡≤12歲；90 d內(nèi)未使用過其他影響腸道菌群的藥物；患兒監(jiān)護(hù)人同意應(yīng)用益生菌輔助治療，并簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等重要臟器功能異常者；合并感染或傳染性疾病者；合并全身炎癥性疾病或免疫功能缺陷者；合并嚴(yán)重精神疾病或認(rèn)知功能障礙者；有益生菌治療相對(duì)或絕對(duì)禁忌證者；治療依從性較差者。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2研究方法 所有患兒在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合益生菌輔助治療，常規(guī)治療：左乙拉西坦[優(yōu)時(shí)比(珠海)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20160085]口服，起始劑量為10 mg/(kg·d)，2/d，此后每周根據(jù)病情在原治療基礎(chǔ)上劑量增加10 mg/(kg·d)，劑量調(diào)整期為3～7周，如劑量調(diào)整期患兒癲癇得到有效控制，則按原有劑量維持治療。如癲癇控制不佳，則按規(guī)律調(diào)整劑量，劑量最高達(dá)到60 mg/(kg·d)后維持治療。益生菌輔助治療：雙歧桿菌三聯(lián)活菌散(上海上藥信誼藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S10970104)1 g口服，2/d。均連續(xù)治療12周。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1臨床療效：依據(jù)Engel分級(jí)[11]評(píng)估患兒治療4、8、12周后癲癇控制情況，Ⅰ級(jí)(顯效)：患兒治療后癲癇無發(fā)作；Ⅱ級(jí)(有效)：患兒治療后較治療前癲癇發(fā)作減少90%～99%；Ⅲ級(jí)(緩解)：患兒治療后較治療前癲癇發(fā)作減少50%～89%；Ⅳ級(jí)(無效)：患兒治療后較治療前癲癇發(fā)作減少<50%或增加?？傆行?(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí)+Ⅲ級(jí))/總例數(shù)×100%。

1.3.2腸道菌群：無菌狀態(tài)下采集新鮮糞便3 g，置于無菌離心管，-20 ℃環(huán)境保存。細(xì)菌培養(yǎng)采用日本光岡知足法，選擇酵母菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及選擇性培養(yǎng)基。細(xì)菌鑒定至菌屬水平采用細(xì)菌三級(jí)鑒定法，下限設(shè)定為2×102CFU/g濕便。取對(duì)數(shù)lgN(CFU/g)記錄菌落水平變化。另外無菌采集新鮮糞便約2 g放入無菌離心管-20 ℃環(huán)境保存。用DNA提取試劑盒QlAamp Baceria DNAKit提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA測(cè)定其濃度并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品PCR片段銬貝數(shù)。將糞便離心洗滌，采用相同方法提取細(xì)菌總DNA。應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)糞便細(xì)菌DNA進(jìn)行熒光定量PCR(試劑盒購(gòu)自AB公司)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共4個(gè)循環(huán)。據(jù)反應(yīng)后擴(kuò)增曲線計(jì)算細(xì)菌拷貝數(shù)，結(jié)果以lg CFU/g濕便表示。

1.3.3炎性因子及免疫因子：治療前后抽取晨起空腹肘靜脈血5 ml，置抗凝管中，離心12 min，取上清液，-80 ℃環(huán)境保存。使用Adlitteram Diagnostic Laboratories公司生產(chǎn)的anthos 2010型酶標(biāo)儀，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-17A水平；應(yīng)用免疫比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平。

2 結(jié)果

2.1臨床療效比較 62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療4、8、12周后，總有效率分別為38.71%、66.13%、85.48%，整體總有效率隨治療時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，不同時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 益生菌輔助治療不同時(shí)間62例兒童難治性癲癇臨床療效比較[例(%)]

2.2治療前后腸道菌群菌落數(shù)變化 62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療12周后，患兒腸道大腸桿菌及糞腸球菌菌落數(shù)較治療前顯著降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)較治療前顯著升高(P<0.05)。見表2。2.3治療前后免疫球蛋白水平變化 62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療12周后，患兒IgA、IgG、IgM水平較治療前顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后腸道菌群菌落數(shù)比較

表3 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后免疫球蛋白水平比較

2.4治療前后炎性因子水平 62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療12周后，患兒TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A較治療前顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后炎性因子水平比較

3 討論

由于CRE發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，因此對(duì)CRE進(jìn)行有效治療仍是兒科疾病中的難題之一。目前，在臨床上對(duì)CRE的治療方案仍在不斷探索中，新型抗癲癇藥物的應(yīng)用及多藥聯(lián)合治療CRE具有較好的臨床效果，但仍有35%患兒得不到有效的控制，因此其他癲癇輔助治療方案受到廣泛關(guān)注[12]。

腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著復(fù)雜的雙向交流機(jī)制，即在健康和疾病背景下相互影響的腦-腸軸，其中腸道菌群紊亂可影響神經(jīng)功能，反之亦然[13]。越來越多的學(xué)者認(rèn)為，腸道菌群可參與癲癇的發(fā)生及發(fā)展。CHEN等[14]研究指出，腦-腸軸異?？蓪?dǎo)致腸易激綜合征的發(fā)生，而腸易激綜合征可使癲癇的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。董楝和馮占輝[15]研究指出，癲癇患者存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，進(jìn)而通過代謝物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、炎性因子、免疫因子等多種途徑引起癲癇的發(fā)生及發(fā)展。故調(diào)節(jié)腸道菌群可作為治療癲癇的新靶點(diǎn)。

益生菌藥物是一種不可消化的食物纖維，含有長(zhǎng)型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌等，可通過選擇性地增加腸道優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)及活性，保障機(jī)體的健康。相關(guān)研究表明，益生菌治療可逆轉(zhuǎn)腸道菌群的失調(diào)，減少致病菌及其代謝產(chǎn)物的黏膜轉(zhuǎn)移，增加抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)上皮表面的完整性；且可通過促進(jìn)黏蛋白分泌，增強(qiáng)腸黏膜屏障功能，阻止腸道病原微生物生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[16-17]。本研究結(jié)果顯示，62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療4、8、12周后，總有效率分別為38.71%、66.13%、85.48%，整體總有效率隨治療時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)；且經(jīng)益生菌輔助治療12周后，患兒大腸桿菌及糞腸球菌菌落數(shù)較治療前顯著降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)較治療前顯著升高。分析原因可能為益生菌輔助治療可減少腸道有害菌群，增加益生菌群，調(diào)節(jié)腦-腸軸，改善其負(fù)面影響，控制癲癇的發(fā)作，本文研究結(jié)果與GOMEZ-EGUILAZ等[18]研究結(jié)果一致。

相關(guān)研究顯示，免疫功能障礙先于癲癇發(fā)作發(fā)生，并能引起癲癇發(fā)作，同時(shí)癲癇發(fā)作可導(dǎo)致免疫功能紊亂及血腦屏障功能障礙[19-21]。免疫功能紊亂可誘導(dǎo)白細(xì)胞活化及細(xì)胞因子的分泌，而上述細(xì)胞因子可通過受損的血腦屏障，誘發(fā)炎性因子的釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)流鉀離子通道的減少及對(duì)于鉀離子緩沖能力的降低，促使神經(jīng)元興奮性上升，導(dǎo)致癲癇發(fā)作閾值降低，引起癲癇發(fā)作，形成惡性循環(huán)。因此有效調(diào)控機(jī)體免疫功能，降低炎性因子的釋放對(duì)改善CRE病情具有積極意義。本研究結(jié)果還顯示，62例CRE經(jīng)益生菌輔助治療12周后，患兒IgA、IgG、IgM水平較治療前顯著升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A水平較治療前顯著降低。分析原因可能為益生菌輔助治療可刺激分泌性免疫球蛋白的生成，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，阻止炎性因子的釋放，提高臨床療效。

綜上所述，益生菌輔助治療CRE具有良好的臨床效果，可顯著降低炎性因子水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)CRE病情控制。但本研究納入病例數(shù)較少，研究周期較短，且未對(duì)益生菌治療的安全性進(jìn)行分析，研究結(jié)果易出現(xiàn)偏移，需要更長(zhǎng)期的臨床隨訪及隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來研究，以期為CRE提供更為安全有效的治療方案。