敵敵畏降解菌的篩選鑒定和降解能力研究

張榮，趙振華，白鶴，賈曉強(qiáng)

(1.天津大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，天津 300350；2.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350；3.天津華勘環(huán)保科技有限公司，天津 300170)

敵敵畏(DDVP)是一種高效的有機(jī)磷殺蟲劑，2018年使用量達(dá)到了104t[1]，嚴(yán)重污染環(huán)境[2]。三氯乙烯(TCE)是含氯污染物的代表物，其已被列入有毒有害水污染物名錄[3]。

DDVP通過(guò)光催化化學(xué)降解[4]、化學(xué)水解[5]和微生物法降解[6]進(jìn)行降解。目前能夠?qū)DVP進(jìn)行降解的細(xì)菌如銅綠假單胞菌、鞘氨醇單胞菌等[7-15]，真菌有曲霉屬、木霉屬和酵母屬等[16-18]。對(duì)TCE進(jìn)行降解的有惡臭假單胞菌屬[19-20]、伯克霍爾德氏菌屬[21]。

本研究以DDVP為唯一碳源，從土壤中篩選出多株高效降解菌，研究其對(duì)DDVP降解特性和生長(zhǎng)最適條件以及對(duì)TCE降解情況,對(duì)農(nóng)藥污染土壤的原位修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DDVP(有效成分含量77.5%)；三氯乙烯由阿拉丁公司購(gòu)得；細(xì)菌基因組提取試劑盒和瓊脂糖凝膠試劑盒均購(gòu)自博邁德生物技術(shù)有限公司；引物由擎科(北京)生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純。

ME204精密天平；FE20K pH計(jì)；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)；HNY-111B恒溫培養(yǎng)振蕩器；GC-430氣相色譜儀；HT-TFG-01通風(fēng)櫥；UV-1200紫外分光光度計(jì)；Powercycler 96 PCR儀；DYY-6C電泳儀；LRH-150生化培養(yǎng)箱；DW-HW328超低溫冰箱；ECLIPSE E200顯微鏡；H1650-W臺(tái)式迷你離心機(jī)。

1.2 土壤樣品采集

于天津市某農(nóng)藥廠污染地塊采集農(nóng)藥污染土樣，約100 g，用封口袋封裝留存。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基(g/L) NH4NO31，K2HPO41，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 5，CaCl20.02，F(xiàn)eSO40.05，酵母粉0.02，pH=7.2。

1.3.2 LB培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5。

1.3.3 YPD培養(yǎng)基(g/L) 酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20。

1.3.4 MRS培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，檸檬酸氫二銨2，葡萄糖20，吐溫80 1(mL/L)，Na2CO35，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，pH=6.5。

1.3.5 富集馴化培養(yǎng)基 MSM培養(yǎng)基依次加10 g/L 土樣+100，300，500 mg/L農(nóng)藥作為碳源，逐級(jí)馴化。

1.4 敵敵畏降解菌分離

參考賀赟[22]的方法,以敵敵畏為唯一碳源，利用菌種馴化、搖瓶富集的方式分離土壤中的降解菌株。具體步驟如下：①在250 mL錐形瓶中加入100 mL MSM液體培養(yǎng)基，并濕熱滅菌。加入100 mg/L 的DDVP，再添加5 g土壤樣品，于30 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)10 d；②取步驟①中的培養(yǎng)液5 mL加入到200 mg/L DDVP的MSM液體培養(yǎng)基中，放于30 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)10 d；③取步驟②中的培養(yǎng)液5 mL加入到300 mg/L DDVP的MSM液體培養(yǎng)基中，放于30 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)10 d。

稀釋涂布后，平板法篩選單菌株。取轉(zhuǎn)接后經(jīng)降解的菌液1 mL于1.5 mL移液管中，以10倍稀釋法稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8、10-9涂平板，篩選單菌落劃線培養(yǎng)[23]。

1.5 敵敵畏降解菌菌株鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 分離得到的目標(biāo)菌株劃線在6種固體培養(yǎng)基平板上，以分離出單菌落，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)、大小、顏色、邊緣等菌落的基本特征。采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。掃描電子顯微鏡觀察菌株顯微結(jié)構(gòu)。

1.5.2 16sRNA基因序列分析 利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取目的菌株基因，以上述提取的基因組DNA為模板，使用16SrDNA通用上游引物27F和下游引物1492R， 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴(kuò)增降解菌株的 16S rDNA 區(qū)域序列。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將PCR產(chǎn)物送往金唯智測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST程序查找同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定種屬。

1.6 敵敵畏降解菌生長(zhǎng)條件探究

1.6.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將篩選菌株按1%接種率接種于對(duì)應(yīng)富集培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)220 r/min，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)。初期每2～3 h取樣測(cè)定OD600(即溶液在波長(zhǎng)為 600 nm 處的吸光值)，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況不同，后期可根據(jù)具體情況調(diào)整測(cè)樣間隔時(shí)間直至菌株生長(zhǎng)到衰退期。

1.6.2 培養(yǎng)條件探究 最適溫度的測(cè)定分5個(gè)水平，分別為20，25，30，37，40 ℃。每個(gè)水平做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。利用分光光度計(jì)法測(cè)定菌濃。

1.6.3 生長(zhǎng)pH條件優(yōu)化 最適pH值的測(cè)定分5個(gè)水平，分別為5，6，7，8，9。每個(gè)水平做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。利用分光光度計(jì)法測(cè)定菌濃。

1.7 DDVP降解率及其耐受能力測(cè)定

1.7.1 DDV農(nóng)藥提取及其分析 降解菌株在對(duì)應(yīng)富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心，去上清，無(wú)菌MSM培養(yǎng)基洗滌菌體3次，并對(duì)菌體進(jìn)行稀釋，制成OD600在3左右的菌液，用等體積培養(yǎng)基懸浮菌體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將菌液按照1% 的接種比例分別接種于含有DDVP 100，200，300，500，1 000 mg/L的無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液中(MSM，不含瓊脂)，搖瓶220 r/min，最適溫度下培養(yǎng)7 d。取上述培養(yǎng)液15 mL，8 000 r/min離心，去除菌體，取上層清液10 mL，加人10 mL丙酮，劇烈振蕩；再加入氯化鈉至飽和，劇烈振蕩1 min，室溫下靜置5 min，使水相與丙酮相分層。移出上層丙酮，過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱，收集流出的丙酮，留待氣相色譜測(cè)定。

1.7.2 氣相色譜測(cè)定條件 GC-430氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器：檢測(cè)用色譜柱為Rxi-1HT(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)非極性色譜柱。方法：進(jìn)口溫度290 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃，載氣為氮?dú)?99.999%)，流速1 mL/min不分流，進(jìn)樣1 μL。程序升溫60 ℃ 保持1 min，以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至170 ℃，280 ℃保持2 min。采用色譜純丙酮為溶劑，按峰面積定量。

底物的降解率計(jì)算：在每個(gè)樣品中，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在計(jì)算出底物殘留峰面積的積分之后，底物降解速率公式如下：

式中,AF指的是殘留底物的峰面積。

1.8 TCE降解率及其耐受能力測(cè)定

降解菌株的培養(yǎng)部分同1.7.1節(jié)，用正己烷萃取培養(yǎng)基中底物。每瓶萃取 2 次，萃取液取至50 mL 試管中，用有機(jī)系濾膜過(guò)濾,去掉細(xì)微雜質(zhì)，將樣品裝入 1.5 mL 的干凈的離心管中，置于-20 ℃ 保藏，待氣相色譜測(cè)定。

氣相色譜條件同1.7.2節(jié)，方法：進(jìn)口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃，載氣為氮?dú)?99.999%)，流速1 mL/min，分流比10∶1，進(jìn)樣1 μL。 程序升溫40 ℃ 保持4 min，以20 ℃/min升至250 ℃。采用色譜純正己烷為溶劑，按峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 DDVP降解菌分離

采用富集培養(yǎng)，逐級(jí)馴化，平板劃線分離的方法，從長(zhǎng)期受DDVP污染的土壤中分離篩選目的菌，在富集培養(yǎng)基上獲得了5株DDVP降解菌株(圖1A)，命名為PD-1、PD-2、PD-3、PD-4、PD-5。對(duì)5株菌進(jìn)行掃描電鏡觀察(圖1B)，菌落形態(tài)特征描述見表1。

表1 菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphology

2.2 DDVP降解菌分子生物學(xué)鑒定

將各個(gè)菌種純化后的PCR產(chǎn)物用DNA測(cè)序，獲得的16SrDNA序列在NCBI中比對(duì)(表2)。

表2 16SrDNA比對(duì)結(jié)果Table 2 16SrDNA comparison result

2.3 環(huán)境因素對(duì)DDVP降解菌生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)5株菌生長(zhǎng)的影響都較大，生長(zhǎng)情況在10～40 ℃范圍內(nèi)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)(圖2A)，檢測(cè)培養(yǎng)24 h的OD600值，5株菌的最適溫度分別為25,25,35,25,37 ℃。pH值4.0～9.0范圍內(nèi)，除PD-1外，其他菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)均隨pH增大而增大(圖2B)，5株菌的最適pH值分別為6，8，7，9，9。

2.4 DDVP降解菌降解率及耐受情況分析

對(duì)5株菌進(jìn)行7 d，5個(gè)濃度梯度的降解率測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 DDVP降解率Table 3 Degradation rate of DDVP

由表3可知，5株菌在DDVP 含量100 mg/L下降解程度均超過(guò)75%，其中PD-3、PD-4降解率超過(guò)了80%，最高降解率為PD-4的82.46%。隨著DDVP濃度的增加，降解率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)DDVP含量達(dá)到1 000 mg/L時(shí)，PD-4降解率為24.89%。

對(duì)5株菌進(jìn)行了TCE降解率測(cè)定，在TCE濃度100 mg/L,30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，PD-1降解率達(dá)到53.57%。5株菌可耐受TCE濃度為500 mg/L。

表4 TCE降解率Table 4 Degradation rate of TCE

2.5 討論

以微生物修復(fù)手段為主的含磷農(nóng)藥污染降解技術(shù)是解決土壤農(nóng)藥殘留的有效途徑。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了很多能夠降解或無(wú)害化農(nóng)藥殘留的微生物，包括真菌、細(xì)菌、放線菌等，其中以細(xì)菌為主。蔡穎慧等[13,23]從污染土壤中分離得到甲基桿菌屬DDW-1，在溫度28 ℃,初始pH為7.0條件下,500 mg/L DDVP經(jīng) DDW-1菌株代謝3 d后,降解率達(dá)63.7%。楊瑞紅等從南疆長(zhǎng)期使用有機(jī)磷農(nóng)藥的梨園采集葉片,分離出DDVP降解菌假單孢菌屬PP-Y1，在pH 6.5,培養(yǎng)7 d條件下DDVP降解率達(dá)53.4%。本研究從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染土壤中篩選出了5株高效DDVP降解菌，經(jīng)鑒定1株屬于氣單胞菌屬，4株屬于芽孢桿菌屬，在DDVP 100 mg/L,裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)7 d條件下，降解率均超過(guò)75%，最高達(dá)到82.46%，比蔡穎慧和楊瑞紅的研究都高。利用微生物降解DDVP潛力巨大，微生物不僅可以降解DDVP，還可以降解其他含磷污染物和其他含鹵污染物，體現(xiàn)了微生物對(duì)環(huán)境的強(qiáng)大適應(yīng)能力。

DDVP降解菌株的效率與環(huán)境因素的影響密切相關(guān)，溫度、pH、DDVP濃度等因子均可以影響它們的降解率。DDVP濃度對(duì)降解率的影響相當(dāng)大，當(dāng)DDVP濃度<300 mg/L時(shí)， DDVP的增加，會(huì)促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，當(dāng)DDVP濃度>300 mg/L時(shí)，則抑制菌株生長(zhǎng)，這與付文祥等[16]的研究基本相同。DDVP是一種復(fù)雜的有機(jī)物，一方面可以作為碳源被微生物利用，另一方面，由于DDVP具有一定的毒性，不能被微生物直接利用，當(dāng)DDVP濃度較大時(shí)，會(huì)阻礙菌株生長(zhǎng)，使生長(zhǎng)量和降解率下降。

除含磷農(nóng)藥對(duì)土壤的污染外，以三氯乙烯為代表物的含氯污染物也會(huì)對(duì)農(nóng)用土地產(chǎn)生污染。錢麗敏從高濃度三氯乙烯污染土壤中分離出一種叢毛單胞菌Comamonassp.以醋酸鈉為共代謝基質(zhì)，10 d對(duì)TCE降解率超過(guò)90%[24]。本文研究了5株菌對(duì)TCE的降解和耐受能力，結(jié)果表明5株菌能夠有效降解和耐受TCE，說(shuō)明在實(shí)際操作中能夠適應(yīng)復(fù)雜的污染環(huán)境，同時(shí)對(duì)多底物進(jìn)行降解。

3 結(jié)論

(1)從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土壤中篩選出了5株對(duì)DDVP有良好降解能力的菌株，確定其最適溫度分別為25,25,35,25,37 ℃，最適pH值分別為6，8，7，9，9。

(2)5株菌表現(xiàn)出高效的DDVP降解能力。在DDVP 100 mg/L,裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)7 d條件下，降解率均超過(guò)75%，最高達(dá)到82.46%。隨DDVP濃度的增大，降解效率不斷降低，當(dāng)DDVP濃度為1 g/L時(shí)，PD-4降解率為24.89%。

(3) 探究了5株菌對(duì)TCE的耐受能力，5株菌在TCE 100 mg/L，裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)5 d條件下，降解率最高為53.57%，并顯示出對(duì)TCE良好的耐受能力。