液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中磺胺類藥物的不確定度評定

王新新，封騰望，王慧姣，李晉成，孫慧武，劉歡*

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室， 北京 100141；2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院， 上海 201306)

磺胺類藥物基本結(jié)構(gòu)是對氨基苯磺酰胺，是可經(jīng)取代反應合成的一類有機化合物的總稱，其磺酰胺基上的氫可被雜環(huán)取代，形成多種多樣的磺胺類化合物[1-2]，磺胺類藥物因其顯著的抗菌作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常被用于預防疾病或作為飼料添加劑[3]。對養(yǎng)殖動物使用磺胺類藥物后，大部分會以藥物本身或其代謝物的形式排出體外，造成其在環(huán)境中的污染和動物體內(nèi)的殘留[4-8]，并經(jīng)食物鏈導致人體內(nèi)磺胺類藥物的富集[9-11]，因此，長期攝入含磺胺類藥物的食品會對人體產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等嚴重的潛在危害[12-13]。

國際食品法典委員會、歐盟和美國都將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，中國《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定水產(chǎn)品肌肉組織中磺胺類藥物總量以及單個磺胺類藥物的最大殘留限量為100 μg/kg[14-16]。目前，水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留常采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定[17-18]，為保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性，有必要對測量不確定度的分量來源進行具體分析，評定影響測定結(jié)果的不確定度[19-20]。根據(jù) 《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定能力評價》 要求，應建立評定測量不確定度的程序，在檢驗檢測過程出現(xiàn)臨界值、內(nèi)部質(zhì)量控制或客戶有要求時，報告測量不確定度。因此，本研究參照農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008，使用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定了草魚(Ctenopharyngodonidella)中10種磺胺類藥物殘留，根據(jù)CNAS-GL06 《化學分析中不確定度的評估指南》[21]和 JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[22]，對測定過程中標準溶液配制、測量重復性、標準曲線擬合、樣品的稱量等引入的不確定度進行分析評定，確定對測定結(jié)果影響較大的不確定度因素，為正確評價和使用檢測數(shù)據(jù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺甲噁唑(SMZ，CAS：723-46-6)、磺胺二甲異噁唑(SFZ，CAS：127-69-5)、磺胺二甲基嘧啶(SM2，CAS：57-68-1)、磺胺甲基嘧啶(SM1，CAS：127-79-7)、磺胺甲二唑(SMT，CAS：144-82-1)、磺胺喹噁啉(SQX，CAS：59-40-5)、磺胺噻唑(STZ，CAS：72-14-0)、磺胺嘧啶(SDZ，CAS：68-35-9)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM，CAS：1220-83-3)、磺胺氯噠嗪(SCP，CAS：80-32-0)標準物質(zhì)均購于德國 Dr.Ehrenstorfer 公司；氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX-D3，CAS：2447-57-6)、氘代磺胺間二甲氧嘧啶(SDT-D6，CAS：122-11-2)均購于德國 Witega 公司；乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，美國 J.T.Baker 公司)；乙酸銨、甲酸(質(zhì)譜級，美國 Fisher 公司)；無水硫酸鎂(上海麥克林生化科技有限公司)。

鮮活草魚購自北京市房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)某養(yǎng)魚場(約1 kg/尾)，于北京市房山區(qū)中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚繁育技術(shù)與工程中心養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)備用。

1.2 儀器與設備

QTRAP?5500超高效液相色譜-三重四級桿/復合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司)； MVM-2500多管渦流混合器(上海泰坦科技股份有限公司)；MS3 Basic 基本型旋渦混勻器(德國IKA公司)；SB-5200DTN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PL2002電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；H-2050R臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；Buchi R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取10.02 mg SMZ、10.03 mg SFZ、10.02 mg SM2、10.03 mg SM1、10.06 mg SMT、10.11 mg SQX、10.09 mg STZ、10.08 mg SDZ、10.19 mg SMM、10.09 mg SCP、10.02 mg SDX-D3、SDT-D6標準品，用甲醇配制成1.0 mg/mL標準儲備液；分別移取適量標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成濃度為100.0 μg/mL、10.0 μg/mL的外標混合標準中間液和內(nèi)標混合標準中間液；以甲醇為溶劑，移取適量混合標準中間液，配制成1.0 μg/mL、100.0 ng/mL外標混合標準工作液和1.0 μg/mL內(nèi)標混合標準工作液，-20 ℃保存。

1.3.2 樣品測定

樣品檢測按照農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008中的操作方法測定SMZ、SFZ、SM2、SM1、SMT、SQX、STZ、SDZ、SMM、SCP殘留量[23]。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相A為 0.1 %甲酸溶液(含5.0 mmol/L醋酸銨)，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下采用多反應監(jiān)測(MRM)模式采集數(shù)據(jù)。離子源的詳細參數(shù)如下：噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：30 psi；霧化氣(GS1)：45 psi；輔助加熱氣(GS2)：55 psi；磺胺類化合物MRM質(zhì)譜參數(shù)參考農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008。

1.4 數(shù)學模型

不確定度評定要從測量全過程的每一個環(huán)節(jié)入手，根據(jù)測定方法，建立草魚樣品中磺胺類藥物殘留量的數(shù)學模型如下：

式(1)

式中：X為樣品中磺胺類藥物的殘留量，單位為μg/kg ；C為從標準工作曲線中得到的樣品中被測組分的質(zhì)量濃度，單位為 ng/mL ；V為試樣最終定容體積，單位為mL；m為稱樣量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

樣品中磺胺類藥物測量不確定度的來源主要有以下幾個方面：外標標準溶液配制引入的不確定度u1；內(nèi)標標準溶液配制引入的不確定度u2；測量重復性引入的不確定度u3；標準曲線擬合引入的不確定度u4；待測樣品稱量引入的不確定度u5；樣品定容引入的不確定度u6。

2.1 外標標準溶液配制引入的不確定度u1

2.1.1 標準物質(zhì)純度的相對標準不確定度

表2 標準物質(zhì)純度引入的不確定度Tab.2 Uncertainty introduced by the purity of standard substances

2.1.2 標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度urel,12

表3 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度Tab.3 Uncertainty introduced by the weighing of standard substances

2.1.3 標準物質(zhì)定容引入的相對標準不確定度urel,13

2.1.4 稀釋過程引入的相對標準不確定度urel,14

綜上，10種磺胺類藥物的外標標準溶液配制引入的相對標準不確定度結(jié)果分別為：

2.2 內(nèi)標標準溶液配制引入的不確定度u2

2.2.1 內(nèi)標標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度urel,21

內(nèi)標標準物質(zhì)純度引入的不確定度見表4。

表4 內(nèi)標標準物質(zhì)純度引入的不確定度Tab.4 Uncertainty introduced by the purity of internal standard reference material

2.2.2 內(nèi)標標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度urel,22

2.2.3 內(nèi)標標準物質(zhì)標準品定容引入的相對標準不確定度urel,23

2.2.4 稀釋過程引入的相對標準不確定度urel,24

2.2.5 內(nèi)標標準物質(zhì)加入體積引入的相對標準不確定度urel,25

綜上，內(nèi)標標準溶液引入的相對標準不確定度結(jié)果如下：

urel,2,SDT-D6=

urel,2,SDX-D3=

2.3 測量重復性引入的不確定度u3

測量重復性引入的不確定度，在實驗中主要是樣品平行測定引入的不確定度，按1.3實驗方法對樣品進行測定，以 6 次測量的平均值作為測量結(jié)果，平均值的標準偏差S(x)及測量重復性引入的不確定度見表5。

表5 重復性測定結(jié)果和不確定度Tab.5 Repeatability determination results and uncertainty

2.4 標準曲線擬合引入的不確定度u4

對標準工作溶液進行測定, 經(jīng)線性擬合得到校準曲線。采用5個濃度水平的混合標準工作液，每個濃度測定6次，以標準溶液濃度Ci為橫坐標，以標準溶液外標峰面積(A外標)與內(nèi)標峰面積(A內(nèi)標)的比值為縱坐標，采用最小二乘法擬合獲得線性回歸方程A=a+b×C(a為截距，b為斜率)和相關(guān)系數(shù)。本研究中對樣品測定液測量次數(shù)為6次，線性回歸導致C0的標準不確定度為u4，根據(jù)下列公式對標準曲線擬合引入的標準不確定度進行計算[16]，結(jié)果見表6。

式(2)

式(3)

式(4)

式(5)

式(6)

表6 最小二乘法擬合標準曲線及不確定度Tab.6 Fitting standard curve and uncertainty by least square method

續(xù)表6，Tab.6 Continued

續(xù)表6，Tab.6 Continued

2.5 樣品稱量引入的不確定度u5

2.6 樣品定容引入的不確定度u6

2.7 合成不確定度uc

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中磺胺類藥物的相對合成不確定度urel和合成標準不確定度uc分別按照urel=

表7 不確定度分量及相對合成不確定度Tab.7 Uncertainty component and relative combined uncertainty

2.8 擴展不確定度U

包含因子取k=2，擴展不確定度按照公式U=k·uc計算，因此，草魚中磺胺類藥物殘留不確定度評定結(jié)果見結(jié)果見表8。

表8 不確定度評定結(jié)果Tab.8 Uncertainty evaluation results

3 結(jié)論

本研究分析了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中10 種磺胺類藥物殘留的不確定度，通過評估各不確定度分量，建立了不確定度評估數(shù)學模型。不確定度評定結(jié)果如圖1所示：經(jīng)過分析和評定發(fā)現(xiàn)影響測定結(jié)果不確定度的主要因素為標準曲線擬合、標準溶液的配制，其次是測量重復性引入的不確定度，樣品定容與樣品稱量引入的不確定度貢獻較小，可忽略不計。因此，在實際操作過程中應盡量提高實驗人員的操作規(guī)范，并選擇經(jīng)過檢定、精度較高的容量瓶與移液管,減少由標準溶液配制引入的不確定度。在檢測磺胺類藥物過程中，可采取增加測量的平行測定次數(shù)或提高標準曲線線性，減少不確定度。此外，還應定期檢定、校準儀器，嚴格管理和維護儀器設備，保持液質(zhì)聯(lián)用儀良好的穩(wěn)定性和較高的靈敏度，來保證檢測結(jié)果的準確度，降低分析結(jié)果的不確定度。

圖1 不確定度分量評定結(jié)果Fig.1 Uncertainty component evaluation results