水產(chǎn)品中5種磷脂含量的HPLC-ELSD檢測(cè)分析

趙新楠，彭吉星，吳海燕，鄭關(guān)超，郭萌萌，文藝曉，王聯(lián)珠，譚志軍*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室， 青島 266071)

磷脂不僅是生物細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和生理代謝調(diào)節(jié)作用，水產(chǎn)品中富含活性不飽和脂肪酸，并且大都以磷脂的形式存在。由于磷脂具有防治心血管疾病，增強(qiáng)免疫力等生物功能特性，是相關(guān)水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[1]。目前磷脂的研究主要集中在大豆和蛋黃中的卵磷脂，水產(chǎn)品中磷脂的研究較少[2-9]。磷脂類化合物種類多，常見的磷脂有20余種，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-18]水產(chǎn)品磷脂主要有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿和鞘磷脂，其中磷脂酰膽堿(卵磷脂)和磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)相對(duì)含量最高，以上5種磷脂占總磷脂含量的90%左右；牡蠣(Ostreagigastnunb)、鮭魚(Oncorhynchus keta)、磷蝦油、魚子、蟹和海膽中5種磷脂占其總磷脂含量的95%以上；貝類、刺參(Apostichopusjaponicas)和海膽(Echinoidea)等雖含有磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)和心磷脂(Cardiolipin，CL)，但僅占磷脂總含量的5%以下(見表1)。因此，本研究中磷脂化合物的分析選擇磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholines，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine，LPC)和鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)5種磷脂。

國內(nèi)針對(duì)磷脂檢測(cè)發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有GB 5537—2008[19]、GB 5009.272—2016[20]、GB/T 35867—2018[21]，以上國標(biāo)方法主要用于植物油或從中提取的卵磷脂中磷脂的檢測(cè)。GB/T 35867—2018和《中華人民共和國藥典》(2015年版)[22]中磷脂的檢測(cè)均用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(High performance liquid chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD)法，但其適用范圍僅涉及到油脂類或藥物用品中磷脂的檢測(cè)，均未涉及水產(chǎn)品。國內(nèi)常用的檢測(cè)方法如比色法、分光光度法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法，只能測(cè)定總磷脂的含量，而且影響因素多，成分的準(zhǔn)確性較差，無法對(duì)其關(guān)鍵成分進(jìn)行定量分析檢測(cè)，另外現(xiàn)有食品國標(biāo)中的磷脂液相色譜檢測(cè)方法檢測(cè)范圍不包括水產(chǎn)品及其制品，導(dǎo)致不能用于分析評(píng)價(jià)水產(chǎn)品及其制品磷脂的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。液相色譜是目前磷脂分離和定性定量分析中最常用的方法，紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是常用檢測(cè)器，其中，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)獨(dú)立于分子中的雙鍵數(shù)目，對(duì)于紫外吸收弱的磷脂類物質(zhì)更為準(zhǔn)確靈敏，適用于不同來源磷脂的檢測(cè)，是目前磷脂分析最常用的方法。

實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化建立了HPLC-ELSD測(cè)定南極磷蝦(Euphausiasuperba)油中磷脂的方法[23]，但是只涉及到磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿3種磷脂，且只分析了南極磷蝦油樣品。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用HPLC-ELSD檢測(cè)不同水產(chǎn)品中5種磷脂的含量，為水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)提供支撐，對(duì)促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展以及水產(chǎn)品高值化利用具有重要的意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

表1 不同水產(chǎn)品中磷脂含量比例Tab.1 The content ratio of phospholipids in different aquatic products

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳山二倍體牡蠣于春季采自威海乳山海洋所鎮(zhèn)南泓村海域；刺參于春季采自威海榮成東楮島海域；磷蝦粉來自青島康境等磷蝦粉加工企業(yè)；虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、螃蟹、海參性腺、海膽醬、鱘魚子，購自青島某超市。磷脂酰膽堿(CAS：8002- 43-5，PC)、磷脂酰乙醇胺(CAS：39382-08-6，PE)、磷脂酰肌醇(CAS：383907-33-3，PI)、溶血磷脂酰膽堿(CAS：9008-30-4，LPC)、鞘磷脂(CAS：85187-10-6，SM)，均購于sigma公司，純度≥98%。鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿、乙醚、丙酮，乙酸均為色譜級(jí)，購自美國默克公司；甲醇、異丙醇、正己烷均為色譜級(jí)，購自賽默飛世爾科技公司。

N-EVAP-24氮吹儀(Organomation公司)；IKA渦旋振蕩器(德國艾卡公司)；KQ-600DE超聲清洗機(jī)(昆山舒美公司)；sigma 4-88離心機(jī)(sigma公司)；CPA 1003P天平(美國賽多利斯公司)；1 000 mg/6 mL氨基固相萃取柱(Waters公司)；Chromolith Performance-Si(100 mm×4.6 mm)硅膠整體柱(Merck公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(Waters公司)；Waters 2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Waters公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量水產(chǎn)品樣品(牡蠣、刺參凍干粉樣品0.200 g；磷蝦粉樣品0.100 g；虹鱒、海膽黃、蟹黃、鱘魚子、海參性腺鮮樣2.00 g)置于50.0 mL離心管中，加入15 mL氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)溶液，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液，對(duì)殘?jiān)貜?fù)上述操作2次，合并上清液至分液漏斗中，加入10.0 mL 0.9%氯化鈉溶液，振蕩搖勻后靜置，收集下層氯仿，氯仿加入適量無水硫酸鈉脫水過濾后于30 ℃氮吹至近干，得到粗磷脂提取物。

采用氨基固相萃取柱完成磷脂的凈化，將粗磷脂提取物置于10.0 mL玻璃試管中，加入2.00 mL氯仿溶解樣品。氨基固相萃取柱先用5.00 mL氯仿活化，將溶解的試樣移入氨基固相萃取柱中，依次用10.0 mL 氯仿-異丙醇(2∶1，V/V)溶液和10.0 mL乙醚-乙酸(72∶1，V/V)溶液淋洗小柱，再依次用10.0 mL甲醇和10.0 mL甲醇-氯仿-2%鹽酸水(100∶200∶1，V/V/V)溶液洗脫，合并洗脫液；在30 ℃下氮吹至近干，加入適量正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液溶解試樣并定容至10.0 mL，取1.00 mL過0.45 μm尼龍濾膜后上機(jī)檢測(cè)分析。

1.2.2 色譜條件

色譜條件參考文藝曉等[23]的研究，柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL/min；載氣壓力：50 psi；漂移管溫度：65 ℃，噴霧器：加熱模式75%；流動(dòng)相：A為正己烷-三乙胺(2 500∶1，V/V)溶液，B為丙醇，C為13%乙酸溶液；梯度洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program of mobile phases

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確稱取30.0 mg磷脂酰膽堿、20.0 mg溶血磷脂酰膽堿、10.0 mg磷脂酰乙醇胺、10.0 mg磷脂酰肌醇和10.0 mg鞘磷脂，用正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液溶解定容至10.0 mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜儀，如圖1所示，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的5種磷脂可以達(dá)到很好地分離效果，而且基線平穩(wěn)、干擾少，能在15 min內(nèi)完成一次分析。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中各磷脂質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)，以相應(yīng)色譜峰峰面積對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。根據(jù)蒸發(fā)光散射檢測(cè)原理y=axb，其中y指峰面積；x指磷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/L)；a、b與蒸發(fā)溫度、流動(dòng)相性質(zhì)等條件有關(guān)的常數(shù)，由于y和x為非線性關(guān)系，因此對(duì)等式兩邊取對(duì)數(shù)，則線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lgy=blgx+lga。

圖1 5種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖(1-PE；2-PI；3-PC；4-SM；5-LPC)Fig.1 Liquid chromatogram of 5 kinds of phospholipid mixed standard solution(1-PE；2-PI；3-PC；4-SM；5-LPC)

1.4 試樣測(cè)定與數(shù)據(jù)處理

取試樣溶液注入液相色譜儀中，按相同色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，外標(biāo)法定量。試樣溶液中各磷脂的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，超出范圍的試樣溶液可適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線及R2值Tab.3 Standard curve and R2 value of phospholipids

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)結(jié)果影響

磷脂按照來源，可分為動(dòng)物來源、植物來源和微生物來源，動(dòng)物性來源的磷脂主要來自蛋黃、腦部組織、肝臟及水產(chǎn)動(dòng)物等，水產(chǎn)動(dòng)物尤其是海洋動(dòng)物含有豐富的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。磷脂標(biāo)準(zhǔn)品分為植物來源(大豆)和動(dòng)物來源(PI為牛肝臟來源，PC、PE、LPC、SM為雞蛋黃來源)2種不同生物來源，如圖2所示，不同來源標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值(峰面積)不同，經(jīng)對(duì)比分析，同濃度的大豆來源磷脂標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積大于動(dòng)物來源標(biāo)準(zhǔn)品(比值在1.11～1.36之間)，影響樣品定量結(jié)果。由于動(dòng)物來源磷脂中脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度和不飽和脂肪酸種類及占比與水產(chǎn)品中磷脂更接近，因此宜選用動(dòng)物性來源標(biāo)準(zhǔn)品。

圖2 5種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖(左圖：大豆來源；右圖：動(dòng)物來源)Fig.2 Liquid chromatogram of 5 kinds of phospholipid mixed standard solution (Left: soybean source; Right: animal source)

2.2 提取、凈化條件優(yōu)化

采用A：氯仿-甲醇(2∶1，V/V)、B：氯仿-甲醇(1∶2，V/V)、C：二氯甲烷-甲醇(2∶1，V/V)、D：95%乙醇、E：乙醇-丙酮(1∶1，V/V)、F：正己烷、G：正己烷-乙酸乙酯(7∶3，V/V)7種有機(jī)溶劑或混合溶液提取南極磷蝦粉中的磷蝦油，比較不同提取溶劑對(duì)南極磷蝦油得率及磷脂含量的影響。由圖3可知，采用95%乙醇溶液和氯仿-甲醇(2∶1，V/V)提取得到的南極磷蝦油得率最高，正己烷提取的南極磷蝦油得率最低，而在正己烷中加入極性相對(duì)較強(qiáng)的乙酸乙酯，磷蝦油得率有明顯提高。

圖3 有機(jī)溶劑提取南極磷蝦油得率Fig.3 The yield of Antarctic krill oil extracted by organic solvent

進(jìn)一步分析不同溶劑提取的南極磷蝦粉中磷脂，如表4所示，通過乙醇提取得到的磷脂在色譜圖中有干擾峰；不同溶劑提取得到南極磷蝦油中均含有PC和LPC，其中95%乙醇和氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液提取得到的PC、LPC和PE含量相近且最高；正己烷提取得到的磷蝦油中PC和LPC含量最少。綜合考慮，本方法采用氯仿-甲醇(2∶1，V/V)進(jìn)行磷脂的提取。

表4 不同溶劑提取的南極磷蝦粉中磷脂含量Tab.4 Phospholipid content in Antarctic krill meal extracted with different solvents (mg·g-1)

根據(jù)前期磷蝦油中磷脂研究及文獻(xiàn)報(bào)道[23-25]，繼續(xù)選用氨基固相萃取柱作為凈化柱。由于前期研究以氯仿-異丙醇(2∶1，V/V)、乙醚-乙酸(72∶1，V/V)、甲醇分別作為淋洗液和洗脫液對(duì)磷蝦油中PE、PC、LPC 3種磷脂進(jìn)行富集凈化，本研究發(fā)現(xiàn)僅用甲醇作為洗脫液時(shí)，PI的洗脫效果較差(PI易溶于氯仿-甲醇)，采用10.0 mL甲醇和10.0 mL甲醇-氯仿-2%鹽酸水(100∶200∶1，V/V/V)兩種溶液洗脫后再合并洗脫液的方法，對(duì)PI有較好洗脫效果。磷蝦油磷脂檢測(cè)結(jié)果表明，磷蝦油中含量最高的是PC，其次為L(zhǎng)PC，最后是PE，與文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂含量趨勢(shì)一致[8]。

2.3 定量限和檢出限

根據(jù)空白樣品加標(biāo)以信噪比(S/N≥10)確定定量限，PC定量限為0.60 mg/g，PE、PI、SM的定量限為0.20 mg/g，LPC定量限為0.40 mg/g。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

采用處理后的牡蠣、虹鱒、磷蝦粉樣品作為空白基質(zhì)，分別添加不同量的磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本方法進(jìn)行驗(yàn)證，具體加標(biāo)量見表5。5種磷脂的加標(biāo)回收率及精密度良好，加標(biāo)回收率范圍為77%～102%，RSD范圍為0.75%～9.78%，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率和良好的精密度。

表5 不同固體基質(zhì)磷脂加標(biāo)回收率和精密度Tab.5 Spiked recovery and precision of phospholipids from different solid matrices

2.5 樣品分析結(jié)果

對(duì)磷蝦粉、牡蠣粉、虹鱒、刺參粉等不同樣品檢測(cè)分析結(jié)果如表6所示，磷蝦粉中主要含有PE、PC、LPC 3種磷脂，其中PC含量在29.71～35.30 mg/g之間，占總磷脂含量的85.20%～90.14%，遠(yuǎn)高于其他樣品，其次為L(zhǎng)PC含量在2.55～4.12 mg/g之間，PE含量為0.99～2.01 mg/g，但PI、SM未檢出；乳山牡蠣凍干粉樣品中PC含量最高，在10.75～12.90 mg/g之間，占總磷脂含量的63.67%～70.08%；其次為PE含量在2.49～4.40 mg/g之間，PI和SM含量分別為1.64～2.32 mg/g和0.46～0.90 mg/g，部分樣品中未檢出；虹鱒鮮樣中也是PC含量最高，含量范圍在5.33～6.64 mg/g之間，占總磷脂含量的65.14%～72.25%，其次為PE含量在2.10～2.55 mg/g之間，PI和SM僅有部分樣品檢出，含量少且低于0.5 mg/g；刺參凍干粉樣品中主要含有PC、PE以及PI，其中PC含量最高，為15.84～20.41 mg/g，占總磷脂含量的74.23%～79.18%，其次為PE含量在2.90～3.69 mg/g之間，PI含量為1.60～2.70 mg/g，但未檢出LPC和SM。

表6 不同水產(chǎn)品樣品中磷脂含量Tab.6 Phospholipid content in different aquatic product samples

此外，對(duì)海膽醬、蟹黃、鱘魚子以及海參性腺等水產(chǎn)品生殖腺組織中磷脂含量分析，含量如表7所示。海膽黃中主要含有PE、PC、LPC、SM 4種磷脂，其中PC含量最高；大閘蟹蟹黃中含有PC、PE和SM 3種磷脂，其磷脂總量和海膽黃相近；鱘魚子醬中只檢出PC，且含量為4種性腺樣品中最高；海參性腺樣品主要含有PE和PC 2種磷脂，但含量較少，均低于1.00 mg/g。

表7 不同水產(chǎn)品性腺中磷脂含量Tab.7 Phospholipid content in gonads of different aquatic products

3 結(jié)論

磷脂的分析檢測(cè)由于儀器、樣品來源、計(jì)算原理、方法不一致等給結(jié)果對(duì)比帶來困難，因此，建立一種統(tǒng)一可用的檢測(cè)方法是十分必要的。本研究建立了HPLC-ELSD測(cè)定水產(chǎn)品中5種磷脂的定性和定量分析方法，并對(duì)方法的回收率及精密度進(jìn)行了驗(yàn)證。樣品分析結(jié)果表明，牡蠣、虹鱒、刺參、磷蝦粉等不同水產(chǎn)品中磷脂含量豐富，但組成和含量存在差異，其中含量最高的磷脂均為磷脂酰膽堿，其次為磷脂酰乙醇胺，其他3種磷脂即溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和鞘磷脂僅在部分樣品中檢出，且含量較少。