牙齦卟啉單胞菌在阿爾茲海默癥發(fā)生中作用的研究進(jìn)展

王冠儒 馮強(qiáng)

山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院微生態(tài)研究室 山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省口腔生物材料與組織再生工程實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250012

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是癡呆病中最常見的類型，其具體表現(xiàn)為情景記憶和認(rèn)知功能的進(jìn)行性喪失，繼而導(dǎo)致語言和視覺空間能力障礙，出現(xiàn)冷漠、攻擊性和抑郁等[1]。對于AD的病理機(jī)制目前研究已經(jīng)比較深入，主要有2個(gè)方面的因素，即Aβ淀粉樣蛋白的沉積和tau蛋白結(jié)構(gòu)的紊亂[2]，但是其病因仍然不明。既往的研究[3-4]顯示，老齡、遺傳因素、心腦血管疾病、糖尿病、肥胖、感染和口腔微生物群失調(diào)等都增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其中，以牙周炎為代表的的口腔微生態(tài)是近年來被廣泛認(rèn)可的AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素，其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingi-valis，P.gingivalis）是導(dǎo)致牙周炎微生物群失衡的關(guān)鍵菌[3]。

P.gingivalis為革蘭陰性厭氧菌，是牙周炎主要致病菌之一。研究[5-6]表明，牙周炎是AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素，如人群回顧性隊(duì)列研究顯示，慢性牙周炎存在10年或更長時(shí)間會(huì)使AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.707倍[5]；牙周炎與AD等的癡呆指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)率的值為1.38（95%可信區(qū)間為1.01～1.90）[6]。

作為牙周炎的主要致病菌，越來越多的研究[7]顯示，P.gingivalis與AD發(fā)生、發(fā)展存在密切的聯(lián)系，如牙周P.gingivalis豐度與AD患者簡易精神量表得分偏低密切相關(guān)。組織病理和免疫病理上的研究[8-9]顯示，P.gingivalis在AD的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，AD患者的腦脊液中可檢測到P.gingivalis的DNA且AD患者與對照組相比額葉灰質(zhì)組之間的P.gingivalis豐度偏高；P.gingivalis的血清抗體檢測顯示，AD患者的IgG水平高于對照組[10-11]。上述研究說明，P.gingivalis可能是牙周炎促進(jìn)AD發(fā)生的重要致病因素。

目前研究已經(jīng)比較明確AD的病理特征，但具體的病因尚未明確。P.gingivalis可能是導(dǎo)致AD發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素，為病因研究提供了一個(gè)新的研究方向，本文對P.gingivalis在AD病因?qū)W方面的相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)梳理，主要從P.gingivalis炎性介質(zhì)分泌及宿主的免疫應(yīng)答角度解析P.gingivalis促進(jìn)AD發(fā)生的潛在致病機(jī)制，為深入開展AD的致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 P.gingivalis釋放炎性介質(zhì)的致病作用

1.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的致病作用

P.gingivalis釋放的LPS根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同可以分為O-LPS和A-LPS，其中A-LPS又可分為四?；腖PS1435/1449和五酰化的LPS1690。A-LPS可以根據(jù)外界環(huán)境的變化改變其結(jié)構(gòu)，對TLR-4產(chǎn)生激動(dòng)作用（LPS1690）或抑制作用（LPS1435/1449），影響宿主的免疫反應(yīng)，從而有助于P.gingivalis適應(yīng)局部炎癥環(huán)境[12]。

P.gingivalis及其LPS是引起中樞和外周神經(jīng)炎癥的強(qiáng)大啟動(dòng)因素，能夠?qū)е履X組織發(fā)生神經(jīng)炎和神經(jīng)退行性變，是引發(fā)AD的重要危險(xiǎn)因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)5周系統(tǒng)地暴露于P.gingivalis-LPS可導(dǎo)致12月齡野生型小鼠腦中Aβ蛋白的聚集及學(xué)習(xí)和記憶障礙[13]。腦組織中的抗原提呈細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)模式識別受體，如Toll樣受體（Toll like receptor，TLR），識別病原微生物所表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式，包括LPS、菌毛等，從而觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)釋放大量促炎細(xì)胞因子[14]。P.gingivalis-LPS可 刺 激TLR-2/4和CD14，激 活TLR4/核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信號通路，包括TLR4/CD14受體、NF-κB和細(xì)胞因子，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)[13,15]。此外，P.gingivalis-LPS通過其他多種方式引起和維持體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，其在AD發(fā)生中的作用值得深入研究。

1.2 牙齦蛋白酶的致病作用

牙齦蛋白酶是影響P.gingivalis免疫顛覆活性的重要毒力因子，主要由3個(gè)不同的基因（rgpA、rgpB和kgp）編碼，前兩者編碼精氨酸特異性牙齦蛋白酶，后者編碼賴氨酸特異性牙齦蛋白酶[16]。RGP和KGP可作用于蛋白酶激活受體2（protease activated receptor，PAR）2，隨后激活的磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和絲裂原激活的蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）激酶/ERK通路有助于小膠質(zhì)細(xì)胞向炎癥區(qū)域遷移[17-18]。

牙齦蛋白酶可通過影響宿主免疫細(xì)胞的補(bǔ)體途徑來逃避免疫監(jiān)視，實(shí)現(xiàn)免疫顛覆，具體機(jī)制為牙齦蛋白酶可以裂解補(bǔ)體成分C1-C5，阻止C3b結(jié)合于細(xì)菌表面并捕獲C4b結(jié)合蛋白，P.gingivalis通過與C4b結(jié)合蛋白的α鏈的補(bǔ)體控制蛋白（complement control protein，CCP）1結(jié)構(gòu)域和CCP6-7結(jié)構(gòu)域結(jié)合[19]，最終阻止膜攻擊復(fù)合體的組裝并獲得調(diào)節(jié)C3轉(zhuǎn)化酶的能力，導(dǎo)致腦組織內(nèi)無法有效清除被感染的細(xì)胞，從而維持或加重AD[16]。

牙齦蛋白酶還可降解腦組織中的tau蛋白，tau蛋白的破碎在誘導(dǎo)不溶性及過度磷酸化的tau蛋白的形成中起關(guān)鍵作用[8]。腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)和tau蛋白的破碎使腦組織內(nèi)tau蛋白結(jié)構(gòu)紊亂，大量錯(cuò)誤蛋白沉積，引起認(rèn)知障礙和功能減退。動(dòng)物研究[8]表明，牙齦蛋白酶的小分子抑制劑可以減輕小鼠的神經(jīng)炎癥并維持海馬區(qū)神經(jīng)元的活性；在犬類模型中，小分子牙齦蛋白酶抑制劑COR388可以穿透口腔生物膜，作用于牙齦蛋白酶靶點(diǎn)，降低口腔內(nèi)KGP活性，進(jìn)而改善AD相關(guān)的病理變化[20]。這些研究說明，牙齦蛋白酶可能在AD發(fā)生過程中具有重要作用，具體機(jī)制值得更深入開展研究。

1.3 肽基精氨酸脫亞胺酶（peptidyl arginine deiminase，PPAD）的致病作用

P.gingivalis能夠分泌PPAD，促進(jìn)蛋白質(zhì)中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化成瓜氨酸，修飾自身和宿主蛋白[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，AD患者的海馬區(qū)PPAD含量增加同時(shí)有大量的瓜氨酸化蛋白積聚，瓜氨酸化的蛋白主要來源為腦組織的結(jié)構(gòu)蛋白如波形蛋白、髓鞘堿性蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等[23-24]。

瓜氨酸化后的蛋白質(zhì)會(huì)改變原來的三維結(jié)構(gòu)，使其功能發(fā)生相應(yīng)變化，導(dǎo)致宿主體內(nèi)炎癥信號網(wǎng)絡(luò)失調(diào)。例如，GFAP是AD患者大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[24]，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞骨架經(jīng)過瓜氨酸化后具有毒性，一方面破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞松解，血腦屏障被破壞，腦組織暴露于全身的炎癥環(huán)境中，細(xì)菌及代謝產(chǎn)物可借此進(jìn)入腦組織中引起神經(jīng)細(xì)胞破壞[25]；另一方面，使與疾病有關(guān)的神經(jīng)元釋放其內(nèi)容物到腦實(shí)質(zhì)并進(jìn)入全身的血液和淋巴循環(huán)，產(chǎn)生自身抗體破壞神經(jīng)細(xì)胞，引起腦組織損傷[26]。由此可見，P.gingivalis導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的破壞和腦組織的損傷可能是P.gingivalis促進(jìn)AD發(fā)生的重要方式之一。

2 P.gingivalis干擾宿主細(xì)胞的免疫功能

2.1 逃避黏膜樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的免疫監(jiān)視

DC為抗原提呈細(xì)胞，是黏膜免疫的主要組成部分，可識別、吞噬和呈遞相關(guān)抗原，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。DC在清除口腔黏膜中的感染微生物和啟動(dòng)次級淋巴器官的獲得性免疫反應(yīng)中起著重要作用[27]。

不同于巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，DC需要保留部分微生物抗原以呈遞給免疫細(xì)胞，因此其內(nèi)部存在抗原清除調(diào)節(jié)機(jī)制，若該機(jī)制失調(diào)，DC便會(huì)在宿主體內(nèi)播散病原體[28]。將表達(dá)不同菌毛的P.gingivalis與人單核細(xì)胞來源的DC共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Mfa1菌毛的P.gingivalis可以激活DC的特異性ICAM-3捕獲非整合素受體，阻止細(xì)胞通過自噬小體和溶酶體途徑清除病原體；表達(dá)FimA菌毛的P.gingivalis可以激活DC的TLR-2受體，促進(jìn)DC破壞清除病原體，P.gingivalis通過調(diào)節(jié)Mfa1和FimA的表達(dá)來逃避自噬，從而在DC內(nèi)存活[28]。該機(jī)制是P.gingivalis在體內(nèi)長期存活，使得機(jī)體長期處于慢性炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致腦組織中神經(jīng)元相關(guān)蛋白代謝異常的基本前提，P.gingivalis借此方式在胞內(nèi)寄生[29]，產(chǎn)生包含有LPS、牙齦蛋白酶以及莢膜、菌毛等毒力因子的微囊泡，持續(xù)向宿主細(xì)胞釋放毒性產(chǎn)物，引起局部及全身的炎癥反應(yīng)[14]。

2.2 干擾小膠質(zhì)細(xì)胞的正常功能

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織正常細(xì)胞，參與腦組織的免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體患有牙周炎時(shí)，炎癥因子以及細(xì)菌成分通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)典途徑和替代途徑，引發(fā)神經(jīng)炎癥[30]。小膠質(zhì)細(xì)胞可向炎癥區(qū)域遷移并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其引起的強(qiáng)烈的神經(jīng)炎癥可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展。

P.gingivalis產(chǎn)生的牙齦蛋白酶可通過牙齦PAR2激活并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和炎癥反應(yīng)[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[17]顯示，在小鼠中P.gingivalis可通過PAR2激活小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后激活的磷酸肌醇激酶/Akt和絲裂原激活的蛋白激酶/ERK激酶/ERK通路刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞遷移和炎癥反應(yīng)。人小膠質(zhì)細(xì)胞系HMC3細(xì)胞感染P.gingivalis實(shí)驗(yàn)[18]表明，P.gingivalis的炎癥分泌物可以吸引小膠質(zhì)細(xì)胞向炎癥部位遷移，小膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)又促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥，可能加劇AD患者的認(rèn)知障礙和記憶喪失。

2.3 導(dǎo)致宿主細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子

P.gingivalis可加重AD的腦內(nèi)炎癥過程。P.gingivalis及其毒性產(chǎn)物水平的升高可通過經(jīng)典和替代途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使其釋放大量促炎細(xì)胞因子[30]。對慢性牙周炎患者和健康人的全血化驗(yàn)進(jìn)行對比顯示，10個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中有5個(gè)與AD的病理相關(guān)，分別為：cofilin-2、磷酸丙糖異構(gòu)酶、組織蛋白酶B、凝聚素和中間α-球蛋白抑制因子H4[31]；感染P.gingivalis的成年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，其腦組織中的促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β的表達(dá)水平升高[32]；P.gingivalis接種組小鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α水平均高于對照組[33]；在長期系統(tǒng)暴露于P.gingivalis-LPS的小鼠的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)功能障礙的啟動(dòng)中，組織蛋白酶B起關(guān)鍵作用[13]。

腦組織內(nèi)的促炎細(xì)胞因子使神經(jīng)細(xì)胞長期處于炎癥狀態(tài)，促進(jìn)Aβ蛋白的合成并抑制其降解，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ蛋白的蓄積[34]。促炎細(xì)胞因子還可引起神經(jīng)細(xì)胞的破壞[35]，導(dǎo)致AD患者的認(rèn)知功能下降。通過P.gingivalis感染的小鼠模型來研究丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB）的神經(jīng)保護(hù)作用顯示SalB可以降低腦內(nèi)IL-1和IL-7的水平，提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平，通過抑制神經(jīng)炎癥來改善小鼠的認(rèn)知障礙[36]。

P.gingivalis通過促進(jìn)宿主細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子來間接作用于腦神經(jīng)細(xì)胞，引起神經(jīng)細(xì)胞的破壞。降低腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子的水平，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平，可能會(huì)起到保護(hù)腦神經(jīng)，改善AD患者的認(rèn)知障礙的作用。

綜上所述，牙周炎的主要致病菌P.gingivalis可能是AD發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一，P.gingivalis可通過多種機(jī)制促進(jìn)AD的發(fā)生、發(fā)展和病情加重（圖1）。

圖1 P.gingivalis促進(jìn)AD發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制Fig 1 Potential mechanism of P.gingivalis promoting the occurrence and development of AD

首先，P.gingivalis具有很強(qiáng)的組織侵襲能力，可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并借由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入自噬小體并阻止自噬小體向溶酶體轉(zhuǎn)化，逃避宿主的免疫監(jiān)視并延長其胞內(nèi)生存期，在所侵襲組織中持續(xù)釋放炎性介質(zhì)[29]。同時(shí)，P.gingivalis可釋放LPS[37]、牙齦蛋白酶[17]以及PPAD[21]等毒性因子，影響宿主的小膠質(zhì)細(xì)胞[30]、黏膜DC[38]及免疫細(xì)胞的補(bǔ)體途徑，導(dǎo)致免疫顛覆[16]，抑制宿主整體的免疫反應(yīng)[39]，使宿主細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致機(jī)體長期處于炎癥狀態(tài)，影響腦組織中相關(guān)蛋白（如tau蛋白）的合成與代謝，使患者腦組織中出現(xiàn)Aβ-42淀粉樣蛋白沉積，引起認(rèn)知障礙和記憶力減退。

患有AD的老年人隨著病情的不斷進(jìn)展，其自我口腔保健能力不斷下降，口腔健康狀況尤其是牙周炎癥程度不斷惡化，又通過上述機(jī)制加重了認(rèn)知障礙，形成惡性循環(huán)[40]。

正常情況下，大腦中基底膜覆蓋的大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞組成血腦屏障，專門用于防止病原體和免疫細(xì)胞到達(dá)大腦造成腦損傷，是先天免疫屏障[41]。P.gingivalis可通過牙周組織進(jìn)入血液循壞造成菌血癥[3]，其蛋白酶成分可以破壞毛細(xì)血管之間的細(xì)胞間質(zhì)，導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子釋放引起血腦屏障的通透性發(fā)生改變，使腦組織暴露于炎癥環(huán)境中。P.gingivalis一方面通過直接影響構(gòu)成血腦屏障的大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的晚期糖基化終產(chǎn)物受體而導(dǎo)致Aβ蛋白在腦內(nèi)蓄積增加[42]，另一方面通過影響血腦屏障的低密度脂蛋白受體連接蛋白1使得Aβ蛋白的清除減少[43]，血腦屏障功能障礙導(dǎo)致淀粉樣Aβ蛋白在腦組織內(nèi)積聚，引起認(rèn)知障礙。

值得關(guān)注的是，AD本身存在遺傳易感性[44]，牙周炎及P.gingivalis與易感基因?qū)е碌恼J(rèn)知功能障礙之間的關(guān)系仍未知。在P.gingivalis的致病機(jī)制方面，雖在免疫炎癥機(jī)制和功能失調(diào)等方面取得部分研究成果，但是目前仍未闡明P.gingivalis導(dǎo)致AD發(fā)生的明確致病途徑。亟待建立大人群的隊(duì)列并進(jìn)行跟蹤隨訪研究，明確P.gingivalis在AD人群中的存在分布規(guī)律，分析口腔健康與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素的密切度及因果關(guān)系；開展P.gingivalis在AD發(fā)病中的作用機(jī)制研究，找出其致病的關(guān)鍵因子和致病方式；開展以P.gingivalis為靶向的AD診斷、干預(yù)、預(yù)防策略研究，從而為AD的治療提供新靶點(diǎn)、新策略和新途徑。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。