時(shí)鐘基因在牙齒發(fā)育中表達(dá)分布與調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

趙曼竹 宋錦璘

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔綜合科 重慶 401147；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 重慶 401147

時(shí)間生物學(xué)（chronobiology）是研究機(jī)體生物節(jié)律及其應(yīng)用的科學(xué)，也是一門新興的生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉性學(xué)科。生物節(jié)律作為生命活動(dòng)的基本特征之一，存在于單核細(xì)胞、動(dòng)物、植物，乃至人類的所有生命活動(dòng)中，依照周期的長(zhǎng)短可以分為短日節(jié)律（wltradian rhythm）、近日節(jié)律（又稱晝夜節(jié)律，circadian rhythm）和長(zhǎng)日節(jié)律（infradian rhythm）等，其中晝夜節(jié)律的研究最為普遍[1-2]。Science曾多次將這一領(lǐng)域評(píng)為“最有可能取得重大突破的領(lǐng)域”。2017年，Jeffreg Hall、Micheal Rosbash和Micheal Young因其在“晝夜節(jié)律調(diào)控分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)”方面的奠基性貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[3]，足以證明晝夜節(jié)律的重要性和學(xué)者們的關(guān)注度。

晝夜節(jié)律是由一系列時(shí)鐘基因周期性表達(dá)與相互作用實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)，時(shí)鐘基因在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究取得了顯著的進(jìn)展，特別是在牙齒發(fā)育中有著重要影響[4]。牙齒硬組織發(fā)育開始于釉牙本質(zhì)界髓角處，之后節(jié)律性地向頸部及面發(fā)育，即每天形成定量的一層基質(zhì)，再礦化形成牙齒硬組織。這種周期性礦化留下了節(jié)律性痕跡，如釉質(zhì)中的釉柱橫紋、芮氏線等[5]，牙本質(zhì)中的馮·埃布納線[6]，牙骨質(zhì)中的纖維牙板[7]。隨著研究的不斷深入，時(shí)鐘基因在牙齒發(fā)育中的表達(dá)特點(diǎn)與調(diào)控作用被逐漸揭開面紗，本文對(duì)此作一綜述。

1 時(shí)鐘基因的反饋抑制理論

隨著研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)時(shí)鐘基因不僅表達(dá)于中樞系統(tǒng)，在外周組織也有表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律的中樞振蕩器存在于下丘腦視交叉上核區(qū)（suprachiasmatic nucleus，SCN），主要通過(guò)感受外界光線的明暗刺激，在調(diào)控中起主導(dǎo)作用。除中樞振蕩器，外周組織中也存在著相似的生物鐘振蕩器，如肝臟、心臟、肌肉、白色脂肪組織等[1]。晝夜節(jié)律的調(diào)控需要中樞和外周振蕩器同步協(xié)調(diào)，由一系列的轉(zhuǎn)錄翻譯正負(fù)反饋通路組成。1990年提出的“反饋抑制理論”，用以解釋周期蛋白含量振蕩現(xiàn)象[8-9]。

反饋抑制理論示意圖見圖1：晝夜節(jié)律正向調(diào)節(jié)因子Bmal1（brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1）和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）在細(xì)胞核內(nèi)形成異源二聚體，共同結(jié)合于其靶基因Per（Period）和Cry（cryptochrome）啟動(dòng)區(qū)的E-box（Ephrussibox）元件，激活轉(zhuǎn)錄信使RNA，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)不斷翻譯產(chǎn)生Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白等目的蛋白。當(dāng)目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中逐漸聚集達(dá)到一定濃度后，可被細(xì)胞質(zhì)中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，隨后穿梭至細(xì)胞核，與Bmal1/Clock二聚體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合含有E-box序列的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，從而發(fā)揮負(fù)向作用，實(shí)現(xiàn)周期蛋白的24 h周而復(fù)始振蕩，構(gòu)成晝夜節(jié)律的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。除Per和Cry以外，Rev-Erb（reverse orientation c-erb）和Ror（RAR-related orphan receptor）也參與維持這個(gè)反饋通路的正常運(yùn)行，即Bmal1/Clock二聚體通過(guò)結(jié)合Rev-Erb和Ror啟動(dòng)區(qū)的E-box元件，激活表達(dá)Rev-Erb和Ror蛋白，這些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核直接結(jié)合Bmal1、Clock的增強(qiáng)子Rore元件；但兩個(gè)因子發(fā)揮的作用不同，Rev-Erb發(fā)揮抑制作用，Ror促進(jìn)Bmal1、Clock基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。正是生物鐘系統(tǒng)內(nèi)各關(guān)鍵因子的協(xié)調(diào)作用，有序調(diào)節(jié)下游的時(shí)鐘控制基因表達(dá)，才實(shí)現(xiàn)機(jī)身內(nèi)復(fù)雜的生物節(jié)律活動(dòng)[10-12]。

圖1 核心時(shí)鐘基因的反饋抑制理論示意圖Fig 1 Schematic diagram for the feedback loop of core clock genes

2 時(shí)鐘基因?qū)Ω杉?xì)胞增殖與分化的影響

2.1 胚胎干細(xì)胞

有研究[13-14]報(bào)道，時(shí)鐘基因（如Bmal1、Per2等）在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）內(nèi)不呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的表達(dá)特點(diǎn)；然而當(dāng)ESCs被誘導(dǎo)分化后，則表現(xiàn)出晝夜節(jié)律的表達(dá)特點(diǎn)，所以學(xué)者們認(rèn)為時(shí)鐘因子可能參與ESCs分化的調(diào)控。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)：Clock基因敲除后，ESCs呈現(xiàn)自然分化現(xiàn)象，推測(cè)Clock在多能干細(xì)胞向分化轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用。還有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，去分化逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的誘導(dǎo)型干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPDCs），同樣失去了晝夜節(jié)律特點(diǎn)，也表現(xiàn)為ESCs相似的增殖與多能干性，進(jìn)一步證實(shí)了以上有關(guān)時(shí)鐘基因參與ESCs分化調(diào)控的觀點(diǎn)。干細(xì)胞增殖方面的研究顯示：Bmal1通過(guò)Rev-Erba的響應(yīng)元件RREs調(diào)控細(xì)胞周期檢查點(diǎn)基因p12，從而調(diào)控細(xì)胞周期由靜止期G1期進(jìn)入DNA合成期S期[17]；此外，Per2也會(huì)通過(guò)其協(xié)同因子調(diào)控另一檢查點(diǎn)基因p16，調(diào)控細(xì)胞周期由DNA合成后期G2期進(jìn)入有絲分裂期M期[18]?；谀壳暗难芯浚瑢W(xué)者們[12]認(rèn)為：正因?yàn)镋SCs沒(méi)有晝夜節(jié)律的特點(diǎn)，增殖過(guò)程中不存在間歇期，從而表現(xiàn)出時(shí)鐘基因?qū)SCs增殖的促進(jìn)作用。

2.2 成體干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可表達(dá)時(shí)鐘基因，且參與成骨分化調(diào)控。據(jù)報(bào)道[19]：骨髓來(lái)源的MSCs表達(dá)時(shí)鐘因子Per1。另有研究[20-21]顯示：從Bmal1全敲除和選擇性敲除小鼠分離培養(yǎng)的MSCs成骨分化潛能受損；增齡引發(fā)的Bmal1表達(dá)下調(diào)，MSCs的體外增殖與成骨分化潛能均下降，提示時(shí)鐘因子Bmal1具有正向調(diào)控MSCs的成骨潛能。Per1/Per2或Cry1/Cry2雙敲除小鼠的骨沉積率和骨小梁量均有顯著提升，提示時(shí)鐘因子Per1/Per2或Cry1/Cry2可負(fù)向調(diào)控骨改建[22]。過(guò)表達(dá)Bmal1的成纖維細(xì)胞NIH3T3-E1可顯著提升Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor，Runx）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）等的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)Bmal1具有正向調(diào)控成骨的作用[23]。在牙源性成體干細(xì)胞的研究中，Zheng等[24]報(bào)道：4種主要的時(shí)鐘基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙囊組織中均有表達(dá)。還有研究[25]在牙髓干細(xì)胞中檢測(cè)到Bmal1、Clock、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2時(shí)鐘基因的表達(dá)，具有晝夜振蕩特性，且受含羞草堿、棘球霉素和缺氧條件的影響。本課題組在前期體外實(shí)驗(yàn)[26-27]中也發(fā)現(xiàn)，大鼠外胚間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)Bmal1、Clock、Per1、Per2，除Clock外，其他3個(gè)因子同樣表現(xiàn)出節(jié)律表達(dá)的特點(diǎn)。在牙源性干細(xì)胞與其他組織來(lái)源的干細(xì)胞的對(duì)比研究中，Bmal1、Per2、Rev-Erba在脂肪干細(xì)胞中的節(jié)律表達(dá)特點(diǎn)最明顯，其次是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而在牙髓干細(xì)胞中的節(jié)律表達(dá)不明顯?？赡艿脑蛟谟谥靖杉?xì)胞受外界光暗變化影響最大，其次是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而牙髓干細(xì)胞被保護(hù)在牙齒硬組織中，所受影響最小[28]。

3 時(shí)鐘基因在牙胚發(fā)育中的表達(dá)特點(diǎn)

對(duì)小鼠牙齒發(fā)育的動(dòng)態(tài)追蹤觀察研究[24]顯示：蕾狀期（E14）和帽狀期（E15）牙胚中均未見時(shí)鐘基因表達(dá)，當(dāng)牙胚進(jìn)入鐘狀期（E17）時(shí)，時(shí)鐘基因呈現(xiàn)高表達(dá)，所檢測(cè)的4個(gè)時(shí)鐘基因（Bmal1、Clock、Per1、Per2）中，Per1表達(dá)最強(qiáng)，Per2和Clock呈相似的表達(dá)分布特點(diǎn)，但Per2表達(dá)更強(qiáng)；時(shí)鐘基因不僅在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在牙乳頭和牙囊細(xì)胞中也有表達(dá)。

對(duì)出生后1 d的小鼠牙胚進(jìn)行研究[29]發(fā)現(xiàn)：部分釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）如成釉蛋白（ameloblastin，Ambn）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）等呈現(xiàn)晝夜節(jié)律表達(dá)的特點(diǎn)，即夜間表達(dá)水平降低，但時(shí)鐘節(jié)律經(jīng)典基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙胚中的夜間表達(dá)卻呈上升特點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)微小RNA可能參與調(diào)控牙胚發(fā)育過(guò)程中牙齒硬組織的周期性礦化。出生后4 d，Bmal1、Clock、Per1、Per2在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，Bmal1在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于成釉細(xì)胞；Per2的表達(dá)分布特點(diǎn)與Clock相同，但Per2表達(dá)更強(qiáng)，兩者不僅在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在牙槽骨中也可被檢測(cè)到；Per1的表達(dá)相對(duì)較弱，但在牙槽骨中表達(dá)較強(qiáng)[24]。另有研究[4]報(bào)道，時(shí)鐘因子Bmal1在出生后4 d小鼠牙胚的內(nèi)釉上皮、中間層、星網(wǎng)狀層以及成牙本質(zhì)細(xì)胞層均有表達(dá)，而且另一時(shí)鐘因子Cry1呈現(xiàn)同樣的表達(dá)分布模式。出生后21 d，Per2在小鼠切牙的成牙本質(zhì)和成釉細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，冠切端表達(dá)極弱甚至不表達(dá)；在磨牙牙本質(zhì)細(xì)胞、上皮剩余、牙槽骨的成骨細(xì)胞核中均有強(qiáng)表達(dá)，牙周膜中有表達(dá)，牙髓和牙骨質(zhì)中不表達(dá)[24]。

4 時(shí)鐘基因參與調(diào)控牙齒硬組織生成的機(jī)制研究

Ohtsuka和Shinoda[30]發(fā)現(xiàn)大鼠切牙短周期增量線出現(xiàn)在出生后7～10 d，晝夜增量線出現(xiàn)在12～15 d，從而認(rèn)為SCN對(duì)牙齒硬組織的生長(zhǎng)線有調(diào)控作用，而且SCN對(duì)晝夜光暗的反應(yīng)和功能成熟大約在出生后2周左右。還有研究[31]報(bào)道：SCN損傷會(huì)導(dǎo)致鼠切牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)增量線紊亂，初步證實(shí)晝夜節(jié)律參與牙齒硬組織生成的調(diào)控。也有相反的研究[32]發(fā)現(xiàn)：SCN單側(cè)或雙側(cè)喪失功能后，短周期和晝夜增量線均未出現(xiàn)明顯改變。通過(guò)生物信息學(xué)分析人、大鼠和小鼠的Amelx、Ambn、釉蛋白（enamelin，Enam）、基質(zhì)金屬肽酶（matrix metalloproteinase，Mmp20）基因上游區(qū)域中的E-box元件顯示：在Amelx中，人和小鼠各有1個(gè)E-box，大鼠沒(méi)有；Ambn中，人有3個(gè)E-box，大鼠有2個(gè)E-box，小鼠沒(méi)有；而Enam只有人有1個(gè)E-box；Mmp20中3個(gè)種屬均有多個(gè)E-box[4]。以上研究表明：SCN、Bmal1、Clock、Per1、Per2等時(shí)鐘因子均參與硬組織增量線的生成調(diào)控，但牙齒硬組織的節(jié)律調(diào)控機(jī)制更為復(fù)雜，都不是缺一不可的，確切的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞是牙齒硬組織生成的最重要的功能細(xì)胞。研究[33]顯示：Bmal1和Per2在成釉細(xì)胞中均呈周期性表達(dá)，但2個(gè)峰值出現(xiàn)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)剛好相反。Per2在進(jìn)入夜間前呈現(xiàn)峰值，進(jìn)入夜間后開始下降，這一振蕩特點(diǎn)與Amelx表達(dá)模式高度一致，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)內(nèi)的溶酶體相關(guān)膜受體（lysosome-associated membrane protein，Lamp1）、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase，Car2）、碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子（solute carrier family 4 member 4，Slc4a4）3個(gè)因子與Per2呈相反的振蕩規(guī)律，即夜間表達(dá)量顯著增加[4,34]。這3個(gè)因子均與礦化密切相關(guān)，也印證了釉基質(zhì)生成白天多、礦化沉淀夜間多的規(guī)律，同時(shí)也提示Bmal1可能促進(jìn)礦化，Per2抑制礦化。另有研究[28,33]報(bào)道，成釉細(xì)胞中Per2、Bmal1、過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、Amelx均呈節(jié)律振蕩表達(dá)，Per2敲除后成釉分化能力下降；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Per2通過(guò)信號(hào)軸PPARγ/AKT1/β-catenin（PPARγ/protein kinase B/beta-catenin）正向調(diào)控Amelx表達(dá)、釉基質(zhì)分泌和礦化能力。這一結(jié)論在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[33]中得到印證，即在無(wú)晝夜明暗變化環(huán)境下懷孕2周的小鼠牙胚中，Per2、Bmal1、Amelx、PPARγ、AKT1、βcatenin表達(dá)下降；繼續(xù)觀察出生后小鼠，發(fā)現(xiàn)切牙萌出速度下降，提示晝夜明暗變化促進(jìn)成釉分化與硬組織生成。成牙本質(zhì)細(xì)胞同樣呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的特點(diǎn)，白天分泌的膠原蛋白是夜間的2倍，而且也表達(dá)時(shí)鐘基因，表達(dá)規(guī)律與成釉細(xì)胞存在差異[31]。本課題組前期研究[27-28]也發(fā)現(xiàn)：作為牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙槽骨和牙髓的生成細(xì)胞，神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（ectomesenchymal stem cells，EMSCs）節(jié)律性振蕩表達(dá)per1、per2，且與低親和力神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）密切相關(guān)，p75NTRExIII-/-敲除小鼠切牙的每日礦化量顯著低于野生型和雜合子小鼠。另有研究[35]證實(shí)：p75NTR啟動(dòng)子上的E-box中的-1039位點(diǎn)可與Clock/Bmal1二聚體結(jié)合，影響生物節(jié)律基因Per1、Per2、Rev-Erba等的表達(dá)，參與晝夜節(jié)律調(diào)控。綜上所述，在牙齒硬組織周期性礦化生成過(guò)程中，核心時(shí)鐘轉(zhuǎn)錄因子不僅調(diào)控核心時(shí)鐘基因的表達(dá)，也調(diào)控時(shí)鐘控制基因（clockcontrolled genes，CCGs）的 表 達(dá)，如Amelx、Lamp1、p75NTR等，共同參與牙發(fā)育的晝夜節(jié)律調(diào)控（圖2）[36]。

圖2 時(shí)鐘基因和時(shí)鐘控制基因的信號(hào)調(diào)控通路示意圖Fig 2 Schematic diagram for the signal pathways of clock genes and clock-controlled genes

5 小結(jié)與展望

目前，時(shí)鐘基因在牙胚組織中表達(dá)已基本被證實(shí)，牙齒硬組織，特別是釉質(zhì)和牙本質(zhì)具有節(jié)律生成的特點(diǎn)。時(shí)鐘基因在牙齒胚胎礦化初期（即鐘狀期）開始表達(dá)，參與多種成牙關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控（如Amelx、Ambn、Mmp20、Car2等）。然而，晝夜節(jié)律參與牙齒硬組織周期性礦化活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制研究還很少，時(shí)鐘因子的調(diào)控作用與機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，確切的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

時(shí)間生物學(xué)的出現(xiàn)將生命科學(xué)研究思維由靜態(tài)轉(zhuǎn)向了動(dòng)態(tài)，晝夜節(jié)律分子機(jī)制的相關(guān)研究成果獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，也證明學(xué)者們普遍認(rèn)同生物節(jié)律在生命科學(xué)中的重要性。相信隨著研究的不斷深入，時(shí)鐘基因在牙齒發(fā)育中的調(diào)控作用與分子機(jī)制將被逐步揭示，啟發(fā)學(xué)者用更多的視角解析牙齒發(fā)育理論，提出更科學(xué)的牙再生策略，早日實(shí)現(xiàn)再生人類的“第三副牙齒”。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。