“秩邊”透“水道”針法對早發(fā)性卵巢功能不全大鼠HPO軸和Bcl-2、Bax蛋白的影響研究

馬夢娜，司佳弘，金曉飛△，李佳茹，閆 婧

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450000)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)是40歲以下女性出現(xiàn)卵巢功能衰退，主要以經(jīng)水稀少或斷絕、雌激素值低而促性腺激素值高為特征[1]。國際流行病學(xué)調(diào)查顯示≤40歲女性的患病率約為1%[2]，而我國≤40歲女性的患病率約為2.8%，且逐年上升，影響女性的身心健康[3]?，F(xiàn)階段西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，此療法雖能夠改善患者月經(jīng)不調(diào)、低雌激素水平癥狀，但其有嚴(yán)格的適用人群，且需長期服藥，增大了患者罹患婦科腫瘤的風(fēng)險[4-5]，故探討更安全有效的療法用于防治POI成為該領(lǐng)域的熱點問題。

近年來，針灸療法以安全系數(shù)高、副作用小和療效顯著的優(yōu)勢愈來愈被大家認可[6]?！爸冗叀蓖浮八馈贬樂ㄊ怯妹⑨槒摹爸冗叀毖ㄍ赶颉八馈毖橹鞯尼槾摊煼?，由山西中醫(yī)藥大學(xué)冀來喜團隊根據(jù)先賢經(jīng)驗選取的對穴，并規(guī)范了安全進針的角度和深度發(fā)展形成，通過調(diào)整針刺的角度使針感傳向不同的部位，治療不同的疾病；當(dāng)針尖朝向水道穴方向使針感傳導(dǎo)至前陰部時，能夠治療前列腺病[7]、痛經(jīng)[8]、多囊卵巢綜合征[9]和繼發(fā)性閉經(jīng)[10]等疾病?；诖?，本實驗通過建立POI大鼠模型，探討“秩邊”透“水道”針法對POI大鼠的作用機制，為臨床應(yīng)用“秩邊”透“水道”針法制定有效防治POI的方案提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組

8周齡，體質(zhì)量180～220 g，健康雌性SD大鼠60只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2016-0006]，嚴(yán)格按照山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心要求規(guī)范操作，室內(nèi)溫度控制在23～27 ℃，室內(nèi)相對濕度控制在50%～60%，大鼠攝食飲水自由，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為空白組、模型組、秩邊組、普針組與西藥組，每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(0.2 g/瓶，江蘇恒瑞制藥廠);針灸針具0.15 mm×25 mm(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);戊酸雌二醇片(1 mg/片，拜耳醫(yī)藥公司);Estra-diol (E2)、luteotro hormone(LH)、Follicle-stimulating hormone (FSH)ELISA試劑盒、Bcl-2及Bax抗體(武漢博士德生物工程有限公司);UB102i生物顯微鏡(重慶市奧普光電公司);高速離心機HC-3018(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);酶標(biāo)檢測儀SM600(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 動物模型制備

本實驗參考POI大鼠模型建立的相關(guān)文獻[11]，通過腹腔注射環(huán)磷酰胺建立該模型：模型和干預(yù)組大鼠在第1天腹腔注射50 mg/kg劑量環(huán)磷酰胺，再以8 mg/kg連續(xù)腹腔注射14 d。從造模第8天起每天鏡下檢測大鼠陰道細胞涂片：將無菌棉簽浸入生理鹽水，取出后輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，順時針轉(zhuǎn)動4～5圈后取出，均勻涂抹在載玻片上，晾干后進行HE染色，光學(xué)顯微鏡(100×)下觀察大鼠陰道脫落細胞情況。根據(jù)大鼠動情周期標(biāo)準(zhǔn)[12]，判斷造模結(jié)束時有兩只大鼠動情周期仍然正常，被剔除實驗，其余大鼠進入治療階段。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 秩邊組 依據(jù)《實驗針灸學(xué)》[13]結(jié)合動物骨性標(biāo)志特征定位腧穴。秩邊組：定位“秩邊”穴(在大鼠臀部外側(cè)，股骨大轉(zhuǎn)子與第四薦骨連線的中點的骨性縫隙處)，消毒，選用0.15 mm×25 mm規(guī)格毫針從“秩邊”穴刺向同側(cè)“水道”穴方向，深度約為12 mm，隔日針刺，每次留針30 min，治療1個月。

1.4.2 普通針刺組 定位“三陰交”(內(nèi)踝尖上約10 mm)、“關(guān)元”(臍下約25 mm)和“腎俞”(第2腰椎棘突下旁開7 mm)穴，消毒，選用0.15 mm×25 mm規(guī)格毫針進針，三陰交穴約進針2 mm，關(guān)元穴約進針5～8 mm，腎俞穴約進針5 mm，隔日針刺，每次留針30 min，治療1個月。

1.4.3 西藥組 將戊酸雌二醇片用生理鹽水配置成濃度為0.01 mg/mL溶液，按照0.09 mg/(kg·d)(根據(jù)人鼠比例換算后用藥量)劑量灌胃，1次/d，治療1個月。

1.4.4 空白組和模型組 正常飼養(yǎng)，不予干預(yù)。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

1.5.1 取材 治療結(jié)束，禁食12 h、不禁水，用10%水合氯醛麻醉大鼠，開腹采集腹主動脈血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清后置于-80 ℃冰箱用以后續(xù)ELISA檢測。摘取大鼠的雙側(cè)卵巢，用生理鹽水沖洗干凈，在濾紙上吸干，稱重；左側(cè)卵巢用4%中性多聚甲醛固定；右側(cè)卵巢放入凍存管中經(jīng)液氮凍存后放入-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)蛋白測定。

1.5.2 檢測 卵巢系數(shù)(%)=卵巢重量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。按ELISA試劑盒說明書要求檢測大鼠血清中FSH、LH及E2水平。從多聚甲醛中取出左側(cè)卵巢組織，清水沖洗干凈，修剪多余的脂肪組織，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片(厚5 μm)、HE染色和封片，顯微鏡下觀察卵巢病理變化。右側(cè)卵巢組織勻漿取上清，測定蛋白濃度，加熱變性后電泳、轉(zhuǎn)膜，稀釋一抗(Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜孵育二抗(HRP-羊抗兔IgG 1∶3 000)，滴加ECL溶液曝光顯像，成像分析儀自動成像，軟件ImageJ 分析目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值比值，計算目的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠動情周期涂片

動情前期：以有核上皮細胞為主，伴少數(shù)角化上皮細胞；動情期：滿視野的角化上皮細胞；動情后期：可見數(shù)量明顯的，相差無幾的有核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞；動情間期：以白細胞為主，伴有極少數(shù)上皮細胞。見圖1。

2.2 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

空白組卵巢組織清晰，含有數(shù)量豐富的生長卵泡，顆粒細胞排列規(guī)則，閉鎖卵泡較少；模型組生長卵泡幾不可見，可見大量有皺縮透明帶殘余的閉鎖卵泡，顆粒細胞排列無規(guī)則，滲入卵泡液中；秩邊、普針及西藥組較模型組均可見生長卵泡增多，閉鎖卵泡減少，其中秩邊和西藥組的生長卵泡數(shù)量較普針組增多。見圖2。

2.3 各組大鼠卵巢指數(shù)、FSH、LH及E2水平變化

與空白組比較，模型組和普針組大鼠的卵巢指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，秩邊和西藥組卵巢指數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，普針組略有增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與秩邊組比較，普針組卵巢指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，西藥組卵巢指數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組、普針組FSH水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組FSH水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與秩邊組比較，普針組FSH水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，西藥組FSH水平略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 與空白組比較，模型組LH水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組LH含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與秩邊組比較，普針組LH水平略高，西藥組LH水平略低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組及干預(yù)組E2水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組E2水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與秩邊組比較，普針組E2水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，西藥組E2水平略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)、FSH、LH及E2水平比較

2.4 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2和Bax蛋白水平比較

2.4.1 Bcl-2水平 與空白組比較，模型組和干預(yù)組Bcl-2水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，秩邊組和西藥組Bcl-2水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，普針組Bcl-2水平稍有增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與秩邊組比較，普針組Bcl-2水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，西藥組Bcl-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.4.2 Bax水平 與空白組比較，模型組Bax水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組Bax水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與秩邊組比較，普針組Bax水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，西藥組Bax水平略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.4.3 Bcl-2/Bax值 與空白組比較，模型組和干預(yù)組Bcl-2/Bax水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組Bcl-2/Bax水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與秩邊組比較，普針組Bcl-2/Bax水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，西藥組Bcl-2/Bax水平略低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 大鼠卵巢組織中 Bcl-2、Bax蛋白水平比較

3 討論

中醫(yī)認為POI病機以腎虛為本，系經(jīng)絡(luò)不通、卵巢失養(yǎng)所致[14]?！爸冗叀蓖浮八馈贬樂ㄊ怯妹⑨樛复?，進入盆腔深部，刺激盆叢神經(jīng)，一方面補腎填精、祛瘀通絡(luò)，調(diào)和局部氣血運行以滋養(yǎng)卵巢[9]；另一方面通過刺激盆從神經(jīng)的交感和副交感神經(jīng)，恢復(fù)正常的內(nèi)分泌功能[15]。普針組選穴依據(jù)[16]為檢索與POI相關(guān)文獻選取排名前三的腧穴(“腎俞”“關(guān)元”“三陰交”)組合，具有調(diào)節(jié)腎、肝、脾三臟功能、通沖任和益氣血之效。戊酸雌二醇是臨床常用來治療女性閉經(jīng)、卵巢早衰等疾病的雌激素藥物[17]，選用此藥物作為西藥對照。

HPO軸通過調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期以及性激素水平，從而維持女性正常的生育功能[18]：下丘腦合成釋放促性腺激素釋放激素刺激垂體，激發(fā)其合成分泌FSH和LH作用于卵巢，促進卵泡發(fā)育、排卵和E2的釋放，E2可通過HPO軸再反向作用于垂體。HPO軸這種正、負反饋的雙重調(diào)節(jié)作用使得女性的月經(jīng)周期和內(nèi)分泌水平保持動態(tài)平衡[19]。HPO軸紊亂是POI的主要發(fā)病因素之一，通過調(diào)節(jié)紊亂的HPO軸，可以使多數(shù)卵巢功能衰退的女性月經(jīng)周期恢復(fù)正常[20]。

研究[21-22]證實顆粒細胞具有供給卵母細胞所需能量和促進卵泡發(fā)育的功能，當(dāng)顆粒細胞凋亡時，卵母細胞不再發(fā)育而形成閉鎖卵泡，故顆粒細胞凋亡與否是評價卵泡發(fā)育質(zhì)量的關(guān)鍵據(jù)點。Bcl-2、Bax作為內(nèi)源性(線粒體)凋亡途徑的主要調(diào)節(jié)因子，是顆粒細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)[23]。當(dāng)Bcl-2表達增加時，線粒體膜電位增加，膜的通透性穩(wěn)定，阻礙細胞色素C的釋放，防止其激活下游的凋亡因子caspase家族，增強顆粒細胞對凋亡的抵抗力[24]。若Bax表達增加則會引起線粒體膜電位降低[25]，膜通透性增大，進而釋放細胞色素C進入胞質(zhì)內(nèi)，激活caspase家族，加速了顆粒細胞的凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖[26]。

本實驗結(jié)果表明：注射環(huán)磷酰胺后，大鼠動情周期紊亂，卵巢HE病理切片顯示生長卵泡幾不可見且含有大量閉鎖卵泡，血清FSH、LH升高，E2降低，高度模擬了臨床POI患者的特征，提示成功建立POI大鼠模型；秩邊組、普針組及西藥組可見多個生長卵泡，閉鎖卵泡減少，E2升高,FSH、LH下降，表明經(jīng)過針刺和西藥干預(yù)，POI大鼠卵巢功能衰退的情況均有所改善，而且秩邊組FSH、LH及E2水平優(yōu)于普針組，和西藥組無明顯差異。從分子水平上，大鼠注射環(huán)磷酰胺后卵巢組織中Bcl-2水平下降，Bax水平增加；干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Bcl-2水平均有增加，Bax水平均有下降，其中秩邊組和西藥組中Bcl-2增加和Bax下降水平較普針組明顯，提示“秩邊”透“水道”針法通過調(diào)節(jié)細胞凋亡因子Bcl-2、Bax水平改善卵泡閉鎖情況，顯著優(yōu)于普針組，和西藥組療效相當(dāng)?！爸冗叀蓖浮八馈贬樂ㄒ悦⑨樛瑫r刺激兩穴，針刺穴位少，操作簡便，能夠減少針刺時大鼠的應(yīng)激反應(yīng)對實驗的干擾，療效顯著，較普針組具有一定的優(yōu)勢。

綜上所述，“秩邊”透“水道”針法在一定程度上改善了POI大鼠病理狀態(tài)，同時能夠調(diào)節(jié)紊亂的HPO軸和提高抗凋亡能力，從而起到糾正大鼠衰退的卵巢功能的作用，其療效優(yōu)于普針組；作用機制可能與增加E2含量、減少FSH和LH含量、使HPO軸功能趨于正常、上調(diào)Bcl-2以及下調(diào)Bax蛋白水平從而減緩顆粒細胞凋亡速度和有效降低卵泡閉鎖進程有關(guān)。