腦內(nèi)三磷酸腺苷的光電化學(xué)活體分析

劉愛平， 葉曉雪*， 劉志洪

(1.湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/有機功能分子合成與應(yīng)用教育部重點實驗室，湖北武漢 430062；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

三磷酸腺苷(ATP)作為機體最直接的能量來源[1,2]，參與細胞代謝和各種生化反應(yīng)，在維持大腦功能過程中扮演重要角色。在正常生理狀態(tài)下，腦內(nèi)ATP的濃度受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)，而當(dāng)ATP濃度偏離平衡時則會引發(fā)阿爾茲海默病、帕金森病等多種腦疾病。因此，發(fā)展腦內(nèi)ATP的活體原位檢測方法對于研究相關(guān)的生理和病理過程具有重要意義。基于微電極的電化學(xué)活體分析法在腦科學(xué)研究中已做出了重要貢獻[3 - 5]。光電化學(xué)(PEC)傳感技術(shù)被認(rèn)為是電化學(xué)分析的一個新分支，其檢測原理涉及光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程。具體來說，當(dāng)激發(fā)光照射電極表面的光電活性材料時，產(chǎn)生電子-空穴對，隨后光生電子轉(zhuǎn)移到電極或溶液中，從而產(chǎn)生陽極或陰極光電流信號[6,7]。由于這種激發(fā)信號(光信號)和檢測信號(電信號)分離的特點，使光電化學(xué)傳感具有背景信號低、靈敏度高等優(yōu)點[8,9]。除此之外，光電化學(xué)傳感可在0偏壓下進行檢測，減少了外加電壓對神經(jīng)元的刺激，具有更好的生物相容性。因此，光電化學(xué)傳感是活體分析的潛在有力工具。然而，大多數(shù)光電活性材料需要高能量的光(紫外/可見光)激發(fā)，其組織穿透深度不足，限制了PEC傳感技術(shù)在活體分析中的應(yīng)用。因此，近期有研究者開發(fā)了一種可近紅外激發(fā)的光電活性材料，用于PEC活體分析[10,11]。盡管如此，這些近紅外激發(fā)的光電活性材料仍存在制備復(fù)雜、種類少以及光電轉(zhuǎn)換效率不高等問題，這些因素都不利于PEC傳感技術(shù)在活體分析中的進一步應(yīng)用。

鑭系摻雜的上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)可通過反斯托克斯過程(anti-Stokes process)將低能量的入射光轉(zhuǎn)化為高能量的發(fā)射光，即將近紅外光轉(zhuǎn)化為紫外光和可見光[12,13]。在熒光分析中，以UCNPs作為能量供體構(gòu)建的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系，被廣泛用于活體成像[14,15]。受此啟發(fā)，我們課題組近期發(fā)展了一種基于FRET調(diào)控的光電化學(xué)傳感策略，通過目標(biāo)物與受體探針的化學(xué)識別反應(yīng)來調(diào)節(jié)UCNPs的發(fā)光，實現(xiàn)了對非電活性小分子(SO2)的高選擇性識別，并成功應(yīng)用于腦內(nèi)SO2的活體原位分析[16]。ATP是一種非氧化還原活性的生物小分子，難以通過在電極表面直接氧化還原產(chǎn)生光電流信號，因此需要在修飾電極表面引入一種ATP識別單元，將識別過程轉(zhuǎn)化為可檢測的PEC信號。核酸適配體具有穩(wěn)定性好、選擇性高、易于化學(xué)修飾等特點，將核酸適配體用于識別和檢測ATP的研究已有報道[17-19]，這些報道證明ATP適配體與ATP之間具有很高的親和力，有利于復(fù)雜活體環(huán)境中對ATP的高選擇性檢測。但到目前為止，尚未見將ATP適配體與UCNPs結(jié)合用于腦內(nèi)ATP光電化學(xué)活體分析的報道。

在本文中，我們將UCNPs與四甲基羅丹明(TAMRA)[20]標(biāo)記的ATP適配體(cATP)，組成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系，以碲化鎘量子點(CdTe QDs)作為光電活性材料，共同修飾于微電極表面，構(gòu)建可近紅外激發(fā)的ATP光電化學(xué)微傳感器。該PEC微傳感器已成功應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型中腦內(nèi)ATP的活體原位檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

UV-2550型紫外/可見分光光度計(日本，島津)；RF-5301熒光分光光度計(日本，島津)；CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器)；ME104E/02型電子分析天平(梅特勒-托利多)；MDL-Ⅲ-980型激光器(長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù))。利用三電極體系進行光電化學(xué)和電化學(xué)測量(工作電極：不銹鋼微電極；參比電極：Ag/AgCl電極；對電極：鉑絲電極)，測量光源：980 nm激光器，信號輸出裝置：CHI 660E電化學(xué)工作站。電解質(zhì)溶液：含200 μmol/L抗壞血酸(AA)的人工腦脊液(aCSF:126 mmol/L NaCl、2.4 mmol/L KCl、0.5 mmol/L KH2PO4、0.85 mmol/L MgCl2、27.5 mmol/L NaHCO3、0.5 mmol/L Na2SO4、1.1 mmol/L CaCl2)。

核苷酸購于生工生物工程(上海)股份有限公司，詳細序列如下：cDNA：5′-NH2-(CH2)6-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3′；cATP：5′-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-TAMRA-3′。其他化學(xué)試劑(均為分析純)購自阿拉丁試劑公司；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CdTe QDs及NaYF4∶Yb,Er納米顆粒的制備CdTe QDs的制備：在三口燒瓶中分別加入檸檬酸三鈉(100 mg)、Cd(NO3)2(59 mg)和β-巰基丙酸(25 μL)，溶解在25 mL超純水中，用NaOH調(diào)節(jié)至pH為10.5，然后加入亞碲酸鈉(11.1 mg)和硼氫化鈉(18.9 mg)，升溫至100 ℃反應(yīng)2 h，冷卻至室溫，離心，超聲，取沉淀并洗滌。干燥后于4 ℃保存。

NaYF4∶Yb,Er上轉(zhuǎn)換納米顆粒的制備：稱取Yb(NO3)3(0.6 mmol)、Y(NO3)3(2.34 mmol)和Er(NO3)3(0.09 mmol)加入乙醇和超純水混合溶劑。將所得混合物在水浴鍋上加熱至50 ℃，然后逐滴加入NaF溶液，攪拌并繼續(xù)加熱20 min，將懸浮液轉(zhuǎn)至高壓反應(yīng)釜中，在200 ℃下煅燒10 h。待冷卻至室溫后，底部白色沉淀即為UCNPs，超聲洗滌沉淀，去除雜質(zhì)，分散到超純水中，備用。

羧基功能化NaYF4∶Yb,Er納米顆粒的制備：在圓底燒瓶中加入聚丙烯酸(PAA：300 mg)和二甘醇(16 mL)，通入N2保護以排除空氣，加熱至110 ℃。將上一步制備的UCNPs均勻分散在甲苯溶液中，然后加入圓底燒瓶的混合液中，升溫直至150 ℃反應(yīng)1.5 h，停止加熱，冷卻后加入0.1 mol/L HCl，離心洗滌，得到PAA-UCNPs。

1.2.2 基于UCNPs的熒光探針制備取2.5 mg PAA-UCNPs分散于超純水中，再加入10 mg/mL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和10 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，于37 ℃活化羧基，離心(8 000 r/min，5 min)，洗滌。重新分散于HEPES緩沖溶液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，10 mmol/L，pH=7.4)中，加入cDNA溶液，4 ℃孵育過夜，然后在溶液中加入1%BSA，37 ℃孵育30 min，封閉未反應(yīng)位點。加入含有cATP的雜交緩沖液(pH=7.4)，利用堿基互補配對組裝cATP，離心分離得到基于UCNPs的熒光探針。

1.2.3 納米復(fù)合材料的制備取多壁碳納米管(MWCNTs)分散于超純水中，冰浴超聲30 min，離心(8 000 r/min，5 min)以去除部分尺寸較大的碳納米管，取上清液離心(12 000 r/min，10 min)，將沉淀置于真空干燥箱中干燥得到尺寸較小的MWCNTs。稱取CdTe QDs(2.5 mg)、MWCNTs(0.8 mg)分散在超純水中，室溫下于搖床混合一天，完成自組裝，得到CdTe QDs-MWCNTs光電復(fù)合材料。

1.2.4 微傳感器的構(gòu)建將微電極置于40%HF中刻蝕，洗滌干凈。真空干燥箱干燥，分步置于2.5 μL的含有CdTe QDs-MWCNTs光電復(fù)合材料和熒光探針的溶液中，室溫干燥，再浸涂0.5%殼聚糖，用緩沖液洗滌電極后，干燥備用。

1.2.5 光電化學(xué)微傳感器用于活體炎癥模型中腦部ATP原位檢測昆明小鼠(雌性，25 g左右)40只，分為兩組：劑量組和時間組。劑量組研究脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥模型中，LPS濃度對小鼠腦內(nèi)ATP釋放的影響：小鼠腹腔分別注射不同濃度的LPS(0、3、5、7 mg/kg，200 μL)，給藥30 min后進行腦內(nèi)ATP的活體原位檢測，其中0 mg/kg指腹腔注射200 μL生理鹽水。時間組研究炎癥模型中小鼠腦內(nèi)ATP水平隨時間的變化情況：小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg，200 μL)，并在不同時間點(2、4、6、8、12、24 h)用制備的微傳感器原位檢測小鼠腦內(nèi)ATP的水平變化。

活體分析步驟：通過腹腔注射水合氯醛麻醉劑麻醉小鼠，將小鼠固定在腦立體定位儀上，剔除小鼠頭部毛發(fā)，酒精消毒后，使用手術(shù)刀剪開小鼠頭皮，暴露顱骨，確定小鼠大腦皮層的位置，使用微型手持式顱鉆定位轉(zhuǎn)孔，隨后將工作電極緩緩插入指定腦區(qū)(AP=2.3 mm，ML=2.4 mm，DV=1.5 mm)，對電極和參比電極嵌入大腦皮下組織的相對固定位置。連接電化學(xué)工作站后，采用980 nm激光器作為激發(fā)光源(間隔10 s，激發(fā)10 s),在0 V的偏置電壓下記錄光電流信號。

所有動物實驗均按照中國動物福利委員會實驗動物護理和使用指南進行，并經(jīng)湖北大學(xué)動物倫理與福利委員會批準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

如圖1所示，在980 nm激發(fā)光的照射下，UCNPs將近紅外光轉(zhuǎn)換為545 nm的可見光，從而激發(fā)電極表面的光電活性材料(CdTe QDs)產(chǎn)生光電流信號。當(dāng)cATP通過堿基互補配對偶聯(lián)到UCNPs表面后，由于UCNPs與TAMRA之間發(fā)生FRET，UCNPs的發(fā)光被TAMRA猝滅，導(dǎo)致CdTe QDs難以被激發(fā)，光電流信號猝滅。當(dāng)目標(biāo)物ATP存在時，由于ATP與適配體之間的高親和力作用，cATP與ATP結(jié)合從而脫離UCNPs表面，TAMRA與UCNPs之間距離增大，F(xiàn)RET過程被抑制，UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，進而激發(fā)電極表面CdTe QDs產(chǎn)生較大的光電流信號，且ATP濃度與光電流信號呈正相關(guān)。

圖1 基于FRET原理的PEC傳感平臺檢測ATP原理圖Fig.1 The principle of the FRET modulated PEC sensor for the detection of ATP

2.2 材料表征

對制備UCNPs進行形貌表征。如圖2A，根據(jù)透射電鏡(TEM)結(jié)果，可以看出UCNPs的粒徑均勻(30 nm左右)。利用X-射線粉末衍射(XRD)測試UCNPs結(jié)構(gòu)，如圖2B，其衍射峰位置與β-NaYF4(JCPDS No.16-0334)一致，表明所制備的UCNPs為六方相結(jié)構(gòu)。用PAA對UCNPs進行羧基功能化，不僅可以增加了UCNPs水溶性，也有利于UCNPs后續(xù)的生物修飾。如圖2C，由傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)果可以看出，1 712 cm-1處出現(xiàn)了C=O基團的特征振動峰，表明PAA的成功修飾。此外，還對PAA-UCNPs進行了Zeta電勢分析，從圖2D中可以看出，UCNPs的Zeta電位為+37 mV，PAA修飾后的UCNPs變?yōu)?19 mV，Zeta電勢分析進一步證明了PAA的成功修飾。

圖2 (A)UCNPs的TEM圖；(B)UCNPs的XRD分析；(C)UCNPs(黑色)與PAA-UCNPs(紅色)的FT-IR分析；(D)UCNPs(左)與PAA-UCNPs(右)的Zeta電勢分析Fig.2 (A) TEM image of UCNPs;(B) XRD patterns of UCNPs;(C) FT-IR spectra of UCNPs(black) and PAA-UCNPs(red);(D) Zeta potential of UCNPs(left) and PAA-UCNPs(right)

2.3 光譜分析

為了驗證UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光能否有效激發(fā)CdTe QDs，測試了UCNPs發(fā)射光譜和CdTe QDs的紫外/可見吸收光譜。如圖3A所示，在980 nm近紅外光的激發(fā)下，UCNPs在545 nm有一個較大的發(fā)射峰(藍色曲線)，而CdTe QDs在545 nm處有較大吸收(紅色虛線)，光譜分析結(jié)果表明UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光波長在CdTe QDs的吸收波長范圍內(nèi)，滿足激發(fā)CdTe QDs的條件。測試了染料TAMRA的吸收光譜，TAMRA最大吸收波長在550 nm左右(綠色虛線)，與上轉(zhuǎn)換納米顆粒的發(fā)射光譜(545 nm)匹配，說明當(dāng)兩者距離足夠近時，能夠發(fā)生FRET。將cDNA和TAMRA-cATP修飾到UCNPs表面后，UCNPs在545 nm處的發(fā)光被猝滅，并且TAMRA-cATP濃度的升高而逐漸減弱(圖3B)。進一步地，當(dāng)UCNPs/cDNA/TAMRA-cATP與ATP反應(yīng)后，隨著TAMRA-cATP與ATP結(jié)合并脫離UCNPs表面，UCNPs的熒光恢復(fù)，并且隨著ATP濃度的升高，UCNPs的發(fā)射強度逐漸增加。以上實驗結(jié)果表明，TAMRA與UCNPs之間能夠發(fā)生FRET，同時ATP能夠通過與cATP之間的高親和性結(jié)合調(diào)控FRET效率，進而影響UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度。

圖3 (A)UCNPs的歸一化熒光光譜、TAMRA和CdTe QDs的吸收光譜；(B)UCNPs/cDNA與不同濃度cATP組裝后的熒光光譜；(C)UCNPs/cDNA/TAMRA-cATP與不同濃度ATP反應(yīng)后的熒光光譜Fig.3 (A) Normalized fluorescence spectrum of UCNPs excited at 980 nm,the UV/Vis absorption spectra of TAMRA and CdTe QDs;(B) Fluorescence spectra of UCNPs/cDNA assembling with different concentrations of cATP;(C) Fluorescence spectra of UCNPs/cDNA/TAMRA-cATP reacting with different concentrations of ATP

2.4 FRET調(diào)控光電流信號的可行性

將光電材料和UCNPs組成的熒光探針依次修飾到微電極上，并測試了不同修飾電極的光電流響應(yīng)。由于CdTe QDs-MWCNTs在980 nm波長處的吸收很弱，因此在980 nm的近紅外光的激發(fā)下，只有CdTe QDs-MWCNTs修飾微電極表現(xiàn)出微小的光電流信號(圖4曲線a)。當(dāng)CdTe QDs-MWCNTs和UCNPs共同修飾到微電極表面后，UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極在含有200 μmol/L AA的aCSF中表現(xiàn)出最強的光電流信號，為315.2 nA(圖4曲線b)，說明UCNPs的發(fā)光能夠有效激發(fā)CdTe QDs并產(chǎn)生光電流信號。修飾cDNA后，cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極的光電流略微減小，為285.3 nA(圖4曲線c)，表明cDNA在電極表面的成功修飾。將TAMRA-cATP修飾到UCNPs后，由于TAMRA對UCNPs發(fā)光的猝滅作用，TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極的光電流顯著降低，為91.3 nA(圖4曲線d)。TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極與ATP(80 nmol/L)反應(yīng)后，光電流明顯增強，為185.5 nA(圖4曲線e)。以上實驗結(jié)果表明，ATP與適配體之間的特異性結(jié)合能夠引起光電流信號的改變。

圖4 不同修飾電極的光電流大?。?a)CdTe QDs-MWCNTs/微電極；(b)UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極；(c)cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極；(d)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極；(e)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極與ATP反應(yīng)后Fig.4 Photocurrent of different modified electrodes:(a) CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode;(b) UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode;(c) cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode;(d) TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode;(e) TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs- MWCNTs/Microelectrode after reacting with ATP

2.5 傳感器對ATP的響應(yīng)研究

圖5 (A)微傳感器與不同標(biāo)準(zhǔn)濃度ATP反應(yīng)后的光電流響應(yīng)；(B)光電流大小與ATP濃度之間的線性關(guān)系Fig.5 (A) Photocurrent responses of the constructed microsensors with different concentrations of ATP;(B) Linear relationship between photocurrent and ATP concentration concentrations of ATP:1，5，10，30，40，60，80，100，200，400，600，800，1 000 nmol/L.

2.6 傳感器的選擇性研究

由于活體環(huán)境復(fù)雜，傳感器的選擇性對活體分析十分重要。因此，我們考察了活體生物環(huán)境中共存的一些結(jié)構(gòu)類似物、陰陽離子和氨基酸等物質(zhì)對微傳感器的影響。如圖6所示，共存物質(zhì)對微傳感器的光電流信號基本沒有影響或者影響較小，當(dāng)加入ATP時，光電流顯著增加，說明該微傳感器對ATP具有很高的特異性。

圖6 選擇性測試Fig.6 Selectivity test

2.7 LPS的注射量對ATP含量的影響

LPS是一種常見的內(nèi)毒素，可以誘導(dǎo)小鼠全身性炎癥，我們通過腹腔注射LPS建立小鼠全身性炎癥模型，并用制備的微電極活體原位檢測小鼠腦內(nèi)細胞間質(zhì)中ATP的水平變化。我們首先研究了不同LPS注射量對小鼠皮質(zhì)內(nèi)ATP水平的影響。如圖7所示，腹腔分別注射3 mg/kg、5 mg/kg、7 mg/kg時，光電流分別為35.1 nA、47.0 nA、59.1 nA。相比于對照組(0 mg/kg)光電流信號分別增加了95.0%、161.1%、228.3%。實驗結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)的炎癥會引起腦內(nèi)ATP水平的顯著升高，并且ATP水平會隨著LPS濃度的增加而進一步升高，說明大腦向胞外釋放ATP是應(yīng)對炎癥的方式之一。

圖7 (A)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極在不同濃度LPS誘導(dǎo)下的活體小鼠腦內(nèi)的光電流響應(yīng)；(B)不同濃度LPS誘導(dǎo)下ATP水平的變化Fig.7 (A) Photocurrent response obtained at TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode in cerebral cortex of living mice brains induced by different concentration of LPS;(B) The levels of ATP in mice brains induced by different concentration of LPS

2.8 炎癥時間對ATP濃度的影響研究

我們將制備的微電極用于LPS誘導(dǎo)的全身炎癥小鼠模型中，活體原位檢測不同時間點腦內(nèi)ATP的含量變化，研究了藥物誘導(dǎo)時間與腦內(nèi)細胞間質(zhì)中ATP水平變化的關(guān)系。如圖8所示，在2～6 h內(nèi)，光電流信號隨著LPS注射時間的增加而增大，在LPS注射6 h時，光電流信號達到峰值(47.2 nA)，之后(6～24 h內(nèi))基本保持不變。實驗結(jié)果表明：LPS誘導(dǎo)的炎癥會引起腦內(nèi)ATP含量的增加，并且隨著藥物誘導(dǎo)時間的推移，ATP的釋放進一步增加，在6 h后達到峰值，并且在24 h內(nèi)一直維持在高位，說明炎癥持續(xù)時間較長。

圖8 (A)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極在LPS注射后的不同時間點所獲得的活體小鼠腦內(nèi)的光電流響應(yīng)；(B)LPS誘導(dǎo)后腦內(nèi)ATP水平隨時間的變化Fig.8 (A) Photocurrent response obtained at TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/Microelectrode in cerebral cortex of living mice brains at different time point after LPS injection;(B) The levels of ATP in mice brains over time after LPS injection

3 結(jié)論

本工作針對光電化學(xué)傳感技術(shù)在活體分析應(yīng)用中的難點，即紫外/可見光的組織穿透深度不足，而大多數(shù)光電活性材料難以被近紅外光激發(fā)的問題，引入了上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為近紅外光的接收器和轉(zhuǎn)換器，構(gòu)建了基于光學(xué)調(diào)控原理的光電化學(xué)微傳感器。所制備的微傳感器對ATP具有靈敏、特異性響應(yīng)，光電流信號與ATP濃度在生理濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。最終，構(gòu)建的微傳感器成功應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)炎癥模型小鼠腦內(nèi)ATP的活體原位檢測，并初步探索了炎癥水平與ATP釋放之間的關(guān)系。本工作不僅提高了激發(fā)光的組織穿透深度，有利于光電化學(xué)活體分析應(yīng)用，也拓展了活體分析中光電活性材料的選擇范圍。將為探討ATP在腦疾病中的作用提供很好的活體分析工具。