一種方酸菁染料的聚集體調(diào)控及其在Pb2+檢測中應(yīng)用

張秀鳳， 劉 璐,， 石 磊， 趙樹華,3， 趙 晗， 丁春光， 于麗佳*

(1.華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山 063210；2.國家衛(wèi)生健康委職業(yè)安全衛(wèi)生研究中心，北京 102308；3.有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北大學(xué)),湖北武漢 430062)

鉛在自然界廣泛存在，它是毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一[1]。鉛在環(huán)境中大多以化合物的形式存在，穩(wěn)定性強(qiáng)，不易降解，主要應(yīng)用于蓄電池、冶金和化工等行業(yè)[2,3]。環(huán)境中的鉛能夠通過呼吸、消化等方式進(jìn)入人體，可對人的神經(jīng)、消化和骨髓造血等系統(tǒng)造成損傷[4,5]。與成人相比，幼兒的身體器官還未發(fā)育成熟，因此對鉛更加敏感，長時(shí)間接觸鉛會(huì)造成智力低下，免疫力降低等癥狀[6]。目前，檢測重金屬離子的傳統(tǒng)方法主要是原子吸收光譜法[7]、原子熒光光譜法[8]以及電化學(xué)分析法[9]等。這些方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但是大都需要專業(yè)的技術(shù)人員和昂貴的設(shè)備儀器[10]。紫外光譜儀具有成本低、操作方便的優(yōu)勢。尤其是近些年來，便攜式紫外光譜方法的發(fā)展，使得基于紫外光譜檢測重金屬方法越來越受到人們的重視。

核酸適配體是一段具有三維空間結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列，與配體特異性結(jié)合，具有很高的親和力和穩(wěn)定性[11]。基于核酸適配體構(gòu)建重金屬檢測方法受到研究人員的青睞[12]。我們課題組前期設(shè)計(jì)合成了一些單甲川菁染料和三甲川菁染料，利用核酸適配體構(gòu)建了Pb2+檢測方法，具有較好的特異性[13 - 15]。但是單甲川菁染料和三甲川菁染料的光譜信號(hào)和文獻(xiàn)中報(bào)道的一些探針一樣，大都是位于紫外-可見區(qū)域，其激發(fā)和發(fā)射對于生物體具有一定的損傷(表1)。近紅外區(qū)域的方酸染料組織穿透性增強(qiáng)，細(xì)胞損傷降低[18]。本研究合成了一種方酸類菁染料F-Cl，其吸收信號(hào)接近近紅外區(qū)域，結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定的共振兩性離子特征，磺酸基團(tuán)和季胺鹽部分提高了F-Cl的溶解性；氯原子的修飾增加了自身聚集能力[13]。F-Cl在溶液中可形成二聚體和單體，本研究以G-四鏈體為模板，利用單體和二聚體對其親和力不同，構(gòu)建了一種基于紫外-可見吸收光譜檢測Pb2+體系。

表1 不同探針的Pb2+檢測波長和檢測限

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UV 3600 Plus型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；WFH-2048型手提式紫外分析儀(杭州齊威儀器有限公司)；FX-016型漩渦振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；D1008型離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司)。

5-氯-2-二甲基苯并噻唑(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,3-丙磺內(nèi)酯(>98%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；方酸(98%,上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司)；丙酮、乙醚(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(>99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；吡啶(分析純，河北百靈威超精細(xì)材料有限公司)；Pb2+適配體T30695(5′-GGGTGGGT-GGGTGGGT-3′，上海生工生物工程股份有限公司)；Pb2+，Cd2+(標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，中國計(jì)量學(xué)院)；超純水(≥11.4 ΜΩ·cm(25 ℃)，Millipore公司)。

1.2 Pb2+的檢測原理

G-四鏈體是富含鳥嘌呤(G)的單鏈序列，在金屬離子存在下，富G序列形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)G-四鏈體，實(shí)現(xiàn)空間構(gòu)型的改變。單鏈和G-四鏈體對于不同聚集狀態(tài)具有不同的親和力。低濃度方菁染料F-Cl在超純水中主要以單體形式存在，高濃度F-Cl則更容易堆積成二聚體。T30695是一種Pb2+敏感的核酸適配體，無Pb2+時(shí)，以單鏈形式存在；加入Pb2+后，形成G-四鏈體。如圖1所示，在Pb2+存在下，T30695單鏈形成G-四鏈體，將體系中F-Cl的二聚體解聚成單體；無Pb2+時(shí)，二聚體不會(huì)被解聚。以二聚體和單體的轉(zhuǎn)化能力差異，實(shí)現(xiàn)Pb2+檢測。

圖1 (a)F-Cl化學(xué)結(jié)構(gòu)式[13]和(b)Pb2+檢測原理圖Fig.1 (a) The chemical structure of F-Cl;(b) Schematic diagram of Pb2+ detection mechanism

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 F-Cl方菁染料的合成F-Cl方菁染料的合成采用于等人[13]的方法(圖2)，將化合物1與1,3-丙磺內(nèi)酯在115 ℃回流7 h，待其冷卻至室溫后用丙酮洗滌，過濾，得到中間產(chǎn)物2；將中間產(chǎn)物2與方酸在氮?dú)獗Ｗo(hù)下與吡啶和丁醇混合，115 ℃下回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后過濾產(chǎn)物并用乙醚洗滌沉淀。

圖2 F-Cl染料的合成路線[13]Fig.2 The synthesis route of compound F-Cl[13]

F-Cl核磁共振(NMR)表征：1H NMR(DMSO,400 MHz)，δ：8.90 (s,2H),8.52 (s,1H),8.02 (s,2H),7.86 (s,2H),7.30 (s,1H),5.90 (s,1H),4.38 (s,2H),2.62 (s,2H),1.99 (s,2H)。

1.3.2 樣品處理與光學(xué)性質(zhì)測定將方菁染料F-Cl溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，配制成濃度為500 μmol/L的F-Cl儲(chǔ)備溶液，置于冰箱冷藏；將T30695溶解于超純水中，配制成濃度為100 μmol/L的DNA母液，置于冰箱冷藏；將Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液和Zn2+、K+等金屬離子溶解于超純水中，配制成濃度為500 μmol/L的金屬離子儲(chǔ)備溶液，置于冰箱冷藏。在測試過程中，向超純水體系中加入2 μL 500 μmol/L F-Cl儲(chǔ)備溶液，振蕩混勻后，加入10 μL 100 μmol/L的DNA母液和不同體積的待測金屬離子儲(chǔ)備溶液，振蕩混勻后，室溫下避光反應(yīng)2 h，之后開始檢測樣品在400～800 nm之間的紫外-可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 方酸菁染料F-Cl的聚集調(diào)控

為調(diào)控溶劑極性對方菁染料F-Cl聚集體的影響，將F-Cl(15 μmol/L)溶解于不同比例的DMSO-超純水混合液中。如圖3(a)所示，在超純水中，F(xiàn)-Cl展示出兩個(gè)吸收峰，594 nm處小肩峰(A594nm)為二聚集體吸收峰，648 nm(A648nm)處主峰為單體峰[13]。調(diào)控DMSO和水的不同比例，如圖3(b)所示，隨著體系中DMSO比例的增加，A594nm/A648nm比值逐漸下降，二聚體逐漸消失，單體不斷增加，二聚體開始向單體轉(zhuǎn)化，并發(fā)生紅移現(xiàn)象，說明方菁染料F-Cl的單體會(huì)受到DMSO極性的影響。當(dāng)它們的體積比為2∶8時(shí)，A594nm/A648nm幾乎不變，此時(shí)體系已達(dá)到平衡。

為考察其高級(jí)聚集體形成能力，研究不同濃度F-Cl的紫外-可見吸收光譜。濃度越高，單體越容易聚集成高級(jí)聚集體，由圖3(c)可知，隨著濃度升高，二聚體和單體都有升高。由圖3(d)可知，A594nm/A648nm比值逐漸上升，二聚體的比例越來越高，說明低濃度時(shí)，主要以單體形式存在，高濃度時(shí)，更容易堆積成二聚體。

圖3 F-Cl在不同VDMSO/VH2O中的紫外-可見吸收光譜(a);F-Cl在不同VDMSO/VH2O中的A594nm/A648nm(b);不同濃度F-Cl在超純水中的紫外-可見吸收光譜(c);不同濃度F-Cl的A594nm/A648nm(d)Fig.3 (a) UV-Vis spectra of F-Cl in different ratios of VDMSO/VH2O;(b) A594nm/A648nm value of F-Cl in different ratios of VDMSO/VH2O;(c) UV-Vis spectra of different concentrations of F-Cl in ultrapure water;(d) A594nm/A648nm value of different concentrations of F-Cl in ultrapure water

2.2 影響因素考察

為了排除T30695單鏈對聚集體狀態(tài)的干擾，我們在F-Cl中加入不同濃度的T30695(0、10、20 μmol/L)。如圖4(a)所示，3種濃度的A594nm/A648nm比值幾乎沒有變，這表明T30695單鏈對聚集體狀態(tài)沒有影響。同樣，為了證明Pb2+對F-Cl聚集體狀態(tài)的影響，選擇濃度為0、10、20 μmol/L的Pb2+與F-Cl作用。由圖4(b)可知，A594nm/A648nm比值幾乎沒變，這表明當(dāng)體系中單獨(dú)存在Pb2+時(shí)，對F-Cl聚集體沒有影響。說明體系中單一存在T30695或Pb2+不能誘導(dǎo)F-Cl的二聚集體解聚。

圖4 T30695濃度(a)和Pb2+濃度(b)對A594nm/A648nm比值的影響Fig.4 Effect of concentration of T30695(a) and Pb2+(b) on A594nm/A648nm

2.3 體系反應(yīng)平衡時(shí)間

為了優(yōu)化體系對Pb2+的響應(yīng)時(shí)間，Pb2+(20 μmol/L)和T30695(10 μmol/L)的濃度保持不變，考察不同時(shí)間點(diǎn)的F-Cl二聚體和單體轉(zhuǎn)化能力。不加Pb2+為空白對照組，加入Pb2+后，立即測試紫外-可見吸收光譜。由圖5(a)可知，加入Pb2+10 min后，紫外-可見吸收光譜無顯著改變。由圖5(b)可知，加入Pb2+的10 min時(shí)，A594nm/A648nm比值降低，逐漸接近平衡，說明此方法10 min即可檢測體系中的Pb2+，對Pb2+響應(yīng)快速。

圖5 Pb2+響應(yīng)時(shí)間(a)和反應(yīng)時(shí)間(b)對A594nm/A648nm比值的影響Fig.5 Effect of response time (a) and reaction time(b) of Pb2+ on A594nm/A648nm

2.4 線性范圍與檢測限

向F-Cl(10 μmol/L)/T30696(10 μmol/L)體系中加入不同體積的Pb2+。由圖6(a)可知，隨著Pb2+濃度的增加，二聚體峰逐漸下降，單體峰逐漸升高；由圖6(b)可知，A594nm/A648nm比值下降，直至Pb2+濃度為20 μmol/L時(shí)達(dá)到平衡。這是因?yàn)轶w系中的Pb2+將T30695誘導(dǎo)成G-四鏈體，將F-Cl的二聚體解聚成單體。由圖6(c)可知，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，Pb2+濃度在1～20 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.9986)，根據(jù)3σ/k，得檢測限為0.90 μmol/L。

2.5 特異性

選擇9種常見金屬離子(Pb2+、K+、Cd2+、Cr3+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ag+，母液濃度為500 μmol/L，工作濃度為20 μmol/L)驗(yàn)證方法的特異性。由圖6(d)可知此方法對Pb2+具有很高的特異性。文獻(xiàn)報(bào)道[19]K+是干擾基于核酸適配體Pb2+檢測的金屬元素，但結(jié)果表明K+的干擾較小，說明此方法可排除K+的干擾。

圖6 Pb2+濃度對F-Cl紫外-可見吸收光譜的影響(a);A594nm/A648nm與Pb2+濃度的關(guān)系(b);A594nm/A648nm與Pb2+濃度的線性響應(yīng)(c);F-Cl/T30695體系對Pb2+的特異性響應(yīng)(d)Fig.6 Effect of Pb2+ concentration on UV-Vis absorption of F-Cl aggregates(a);The relationship between A594nm/A648nm and Pb2+ concentration(b);The linear response between A594nm/A648nm and Pb2+ concentration(c);The specificity of F-Cl/T30695 system for Pb2+ detection(d)

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證該檢測手段在自來水中的實(shí)用性，進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表2可知，加入的Pb2+濃度與實(shí)際測得的濃度差異較小，回收率在94.7%到100.2%的范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤2.21%。該結(jié)果表明此方法具有很好的重現(xiàn)性，對自來水中的Pb2+測試具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表2 水樣中Pb2+的測定

3 結(jié)論

開發(fā)了一種特異性且快速響應(yīng)的Pb2+檢測方法。該檢測方法以Pb2+響應(yīng)的G-四鏈體為模板，利用單鏈和G-四鏈體對F-Cl二聚體和單體響應(yīng)能力差異，實(shí)現(xiàn)Pb2+檢測。該方法操作簡單，僅需紫外光譜表征，10 min內(nèi)快速響應(yīng)Pb2+，在1～20 μmol/L內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，其檢測限為0.90 μmol/L。