泛醌對大鼠背部皮瓣缺血再灌注損傷的作用與影響

張曉藝 張浩

皮瓣移植是目前修復(fù)難愈性創(chuàng)面與器官重建的最有效辦法[1]，其成功的關(guān)鍵在于保證術(shù)后皮瓣的血液通暢[2]，而皮瓣的缺血再灌注損傷是皮瓣移植失敗的重要原因之一[3-4]。本實驗通過建立大鼠皮瓣模型來探究皮瓣缺血再灌注損傷的有效治療措施及相關(guān)藥物的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選用佳木斯大學(xué)動物實驗中心的成年雄性SD大鼠（SPF 級）120 只，體質(zhì)量（350±50）g，（10±2）周齡，均予單籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃，濕度49%。本研究全程遵循動物實驗倫理要求。

1.2 實驗方法

120 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、實驗組和對照組三組，每組各40 只，背部提前2 d 刮除毛發(fā)（8%硫化鈉）。手術(shù)當(dāng)天大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使之俯臥于實驗臺上，常規(guī)術(shù)區(qū)消毒。設(shè)計9.0 cm×6.0 cm 的背部皮瓣，以背中線為中軸線，蒂部處下位，上起自兩肩胛下角連線，下至髂后上棘水平線，沿標(biāo)記切開，分離組織，掀起皮瓣，結(jié)扎6 條大鼠背部皮膚主要供血血管的其中5 條，即左右胸背動脈、左右肋間動脈及左側(cè)髂腰動脈，僅保留一條右側(cè)髂腰動脈為大鼠背部皮瓣唯一供血血管，建立以右側(cè)髂腰動脈為單一血管蒂的穿支皮瓣，實驗組及對照組用顯微血管夾夾閉蒂部血管即右側(cè)髂腰動脈根部6 h 以后松開，三組均于手術(shù)操作后原位縫合。以此方式得到以大鼠背部單一血管為血管蒂的動物皮瓣缺血再灌注損傷模型（圖1 A-F）。

1.3 術(shù)后處理

模型建立成功后，所有大鼠連續(xù)3 日給予慶大霉素（1.5 mg/kg）預(yù)防感染。實驗組每天用灌胃給藥方式給予溶于食用油的泛醌（Blackmores 公司，澳大利亞）50 mg/kg；為保證單一變量，假手術(shù)組和對照組每天給予等量的橄欖油，灌胃體積均為5 mL/kg。實驗期間動物飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物實驗中心，符合無特定病原體標(biāo)準(zhǔn)，單籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃，濕度49%，每日自由進食飲水。術(shù)后1、3、5、7 d 每組處死10 只大鼠。

1.4 觀察指標(biāo)

測量皮瓣存活面積，計算皮瓣存活率：覆蓋透明膜，在透明膜上畫出創(chuàng)口輪廓。清洗干燥后，沿著輪廓剪去多余的膜，記錄剩余膜的重量（確保為同一人同一支筆）。皮瓣存活率=皮瓣存活部分對應(yīng)透明膜重量/整個皮瓣對應(yīng)透明膜重量×100%。

于皮瓣中央取1.0 cm×1.0 cm 大小的皮瓣組織，平均分為兩半，一半行固定、包埋、切片、HE 染色后于顯微鏡下觀察所取皮瓣組織細胞的存活情況；另一半從分子水平檢測所取皮瓣中超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量（圖1 G-H）。

圖1 實驗方法Fig.1 Experimental method

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS25.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。連續(xù)性變量以表示，各指標(biāo)在不同時間點的差異性分析采用重復(fù)測量方差分析，若時間和分組兩因素的交互作用不具有統(tǒng)計學(xué)意義，則關(guān)注兩因素的主效應(yīng)，若交互作用存在統(tǒng)計學(xué)意義，則分析兩因素的單獨效應(yīng)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣存活率（表1）

表1 各組皮瓣存活率（%）Table 1 Flap survival rates in each group (%)

統(tǒng)計學(xué)分析顯示，在時間上，F(xiàn)=311.128，P=0.000；在分組上，F(xiàn)=1 311.321，P=0.000；交互F=77.260，P=0.000，分析單獨效應(yīng)。

在時間上，除假手術(shù)組第5 天和第7 天，實驗組第3 天和第5 天、第5 天和第7 天皮瓣存活率比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），其他各組各時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在分組上，各時間點各組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 HE 染色結(jié)果（圖2）

圖2 HE 染色觀察各組大鼠皮瓣（40×）Fig.2 HE staining of rat flaps in each group (40×)

2.2.1 對照組

第1 天：皮膚組織結(jié)構(gòu)重度異常，組織糜爛，大量肌纖維及膠原纖維壞死變性（黃色箭頭所示）；鈣化明顯（黑色箭頭所示）；炎性細胞數(shù)量多、分布廣泛（紅色箭頭所示）；出血明顯（綠色箭頭所示）。第3 天：皮膚組織結(jié)構(gòu)中度異常，大量肌纖維壞死、性狀發(fā)生變化（黃色箭頭所示）；可見病理性鈣化（黑色箭頭所示）；組織可見大量炎癥細胞廣泛分布（紅色箭頭所示）；膠原纖維的排列及分布情況發(fā)生改變甚至紊亂（綠色箭頭所示）；少量脂肪細胞浸潤（藍色箭頭所示）。第5 天：皮膚組織結(jié)構(gòu)中度異常，部分肌纖維壞死，并可見鈣化（紅色箭頭所示）；組織可見大量炎癥細胞（黑色箭頭所示）；脂肪細胞不明顯（黃色箭頭所示）。第7 天：組織結(jié)構(gòu)中度異常，部分膠原纖維排列紊亂，壞死（黑色箭頭所示）；大量新幼毛細血管、紅細胞存在于各組織間隙內(nèi)（紅色箭頭所示）；有脂肪細胞出現(xiàn)但數(shù)量較少（黃色箭頭所示）。

2.2.2 實驗組

第1 天：皮膚組織結(jié)構(gòu)重度異常，大部分肌纖維壞死，鈣化區(qū)域明顯（紅色箭頭所示）；組織內(nèi)可見炎癥細胞廣泛分布（黑色箭頭所示）。第3 天：組織結(jié)構(gòu)中度異常，少部分肌纖維及膠原纖維壞死（黃色箭頭所示）；組織可見很少的炎癥細胞分布于各組織之間（黑色箭頭所示）；新生血管也出現(xiàn)了一些，但數(shù)量極少（紅色箭頭所示）。第5 天：組織結(jié)構(gòu)中度異常，膠原纖維的情況較好，排列較為有規(guī)律，肌纖維壞死情況及組織鈣化程度不是很嚴重（黃色箭頭所示）；有新生血管出現(xiàn)（紅色箭頭所示）；炎癥細胞明顯分布稀疏（黑色箭頭所示）。第7 天：組織結(jié)構(gòu)輕度異常，炎癥細胞幾乎不可見但仍有零星散落（黑色箭頭所示）；血管有增多現(xiàn)象及趨勢，膠原纖維排列規(guī)律規(guī)整；可見脂肪細胞浸潤（紅色箭頭所示）。

2.2.3 假手術(shù)組

第1 天：組織結(jié)構(gòu)輕度異常，纖維排列不規(guī)整，組織間隙因為水腫而增大（黑色箭頭所示）；有炎癥細胞的存在（紅色箭頭所示）。第3 天：組織結(jié)構(gòu)輕度異常，纖維排列些許不規(guī)整，有炎癥細胞存在但數(shù)量極少（紅色箭頭所示）；有很多側(cè)枝循環(huán)建立（黑色箭頭所示）。第5 天：組織結(jié)構(gòu)輕度異常，膠原纖維排列規(guī)范，有側(cè)枝循環(huán)建立，且數(shù)量多、新生血管成熟（黑色箭頭所示）；組織之間炎性細胞零散分布，數(shù)量極少（紅色箭頭所示）。第7 天：組織結(jié)構(gòu)可以說幾乎全部正常，膠原纖維排列規(guī)整，組織間無炎性細胞存在。

2.3 皮瓣組織SOD 檢查結(jié)果（表2）

表2 各組皮瓣組織SOD 檢測結(jié)果（U/mg）Table 2 SOD test results of flap tissues in each group (U/mg)

統(tǒng)計學(xué)分析顯示，在時間上，F(xiàn)=1 853.869，P=0.000；在分組上，F(xiàn)=9 038.282，P=0.000；交互F=182.644，P=0.000。

皮瓣組織SOD 在時間上，各組兩兩比較均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在分組上，各時間點各組兩兩比較均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.4 皮瓣組織MDA 檢測結(jié)果（表3）

表3 各組皮瓣組織MDA 檢測結(jié)果（nmol/mg）Table 3 MDA test results of flap tissues in each group (nmol/mg)

統(tǒng)計學(xué)分析顯示，在時間上，F(xiàn)=243.786，P=0.000；在 分 組 上，F(xiàn)=827.107，P=0.000；交 互F=55.507，P=0.000。

皮瓣組織MDA 在時間上，各組兩兩比較均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在分組上，除第7 天假手術(shù)組和實驗組皮瓣組織MDA 無統(tǒng)計學(xué)差異外（P＞0.05），其余均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組的皮瓣存活率優(yōu)于實驗組，實驗組優(yōu)于對照組。這證明造模是成功的，缺血6 h 確實達到了缺血再灌注損傷的目的。從表1 來看，假手術(shù)組術(shù)后第5 天與第7 天皮瓣存活率無明顯差異，說明未經(jīng)缺血再灌注損傷的皮瓣在第5 天已達到愈合的最佳狀態(tài)。實驗組第3 天與第5天、第5 天與第7 天之間均無差異，說明在第3 天已基本控制住皮瓣的壞死情況，但其恢復(fù)情況在給藥狀態(tài)下也不如假手術(shù)組。對照組在不用泛醌的情況下皮瓣存活率一直在下降，最后僅剩一半左右。從皮瓣存活率來看，缺血再灌注損傷的發(fā)生是客觀存在的，但在抗氧化劑泛醌的作用下，皮瓣存活率已無明顯下降。我們還同時測得了組織中SOD 和MDA 相對應(yīng)的數(shù)值。SOD 可以幫助清除氧自由基，其數(shù)值越高說明皮瓣存活情況越好，通過表2 可以發(fā)現(xiàn)，無論是時間線上的對比還是不同組別之間的對比，其差異都是有統(tǒng)計學(xué)意義的。MDA 是組織發(fā)生缺血再灌注損傷過程中的負面產(chǎn)物，數(shù)值越高說明皮瓣存活情況越不好，通過表3 可以發(fā)現(xiàn)，僅術(shù)后第7 天假手術(shù)組與實驗組不存在統(tǒng)計學(xué)差異，這說明用藥1周后，皮瓣的炎癥及過氧化等反應(yīng)已基本得到控制。為了從組織水平再次確認泛醌究竟是否改善了皮瓣組織的存活情況，我們對取到的皮瓣組織進行了HE 染色，發(fā)現(xiàn)對照組情況最差，雖然第7 天時已可見毛細血管生成但仍有組織壞死、膠原纖維排列紊亂的現(xiàn)象。實驗組第3 天的情況與其相似，第5 天雖也有少量肌纖維壞死，但膠原纖維排列尚規(guī)整，炎癥細胞的分布也明顯分散。假手術(shù)組情況最好，僅在初期有纖維排列輕度異常、水腫間隙增大等組織結(jié)構(gòu)的輕度異常，第7 天時存活組織已基本正常。研究表明，軸型皮瓣的真實成活范圍其實是略大于蒂部血管供血范圍的，因為皮瓣的四周會產(chǎn)生超灌注現(xiàn)象。據(jù)此可以解釋我們得到的數(shù)據(jù)情況相比肉眼觀察的結(jié)果要更好一些。同時，我們也可以推測，即使部分血管斷流也可以使皮瓣成活范圍超過存活血管支配區(qū)域。

關(guān)于缺血再灌注損傷的機制的研究很多，其中活性氧自由基的作用學(xué)說已在多項實驗中得到證實[5]。如果只是氧自由基增多且其清除途徑正常的話，尚不能對組織造成明顯傷害，關(guān)鍵在于清除氧自由基的酶類也會出現(xiàn)合成障礙、被清除過多等問題[6]。首先，缺氧和缺血誘導(dǎo)線粒體無氧代謝進而發(fā)生功能障礙。ATP 減少時離子泵的功能受到影響，鈣離子滯留細胞內(nèi)就會使細胞發(fā)生腫脹、其內(nèi)酶系統(tǒng)就會被抑制。其次，液體再次回到組織器官時各種酶會因線粒體及電解質(zhì)的狀態(tài)而促進氧化反應(yīng)[7]。最后，ROS滯留，誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。

泛醌又叫輔酶Q10（CoQ10），具有親脂性，是細胞內(nèi)信息傳遞過程和物質(zhì)轉(zhuǎn)移過程的重要組成部分[9]，具有防止脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化的作用[10]，主要通過維護遺傳信息來維持細胞的生存，同時可以降低細胞死亡、凋亡的概率[11]。本研究中，實驗組術(shù)后給予泛醌，使其皮瓣存活面積明顯優(yōu)于對照組，SOD和MDA 的檢測結(jié)果也證實了泛醌的作用。

綜上所述，本研究成功制備了大鼠缺損再灌注損傷模型，并證實泛醌可有效減輕大鼠背部超大皮瓣的缺血再灌注損傷情況。