增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記膀胱癌外泌體的構(gòu)建及其體外示蹤作用

陳輝 侯愛華 王培培 梅曉峰

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥發(fā)病率中排第十[1]。外泌體是直徑約40～160 nm 的細(xì)胞外囊泡，起源于細(xì)胞內(nèi)吞作用形成的早期內(nèi)體，而后在其他細(xì)胞內(nèi)囊泡和細(xì)胞器的相互作用下被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[2]。外泌體的膜結(jié)構(gòu)為磷脂雙分子層，膜上含有多種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，外泌體內(nèi)部也含有多種生物活性分子，如RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[3－4]。細(xì)胞通過外泌體在細(xì)胞間傳遞生物活性分子，進(jìn)行信息交流[5]。已有研究表明，外泌體與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、診斷和治療密切相關(guān)[6]。

為了明確外泌體的體內(nèi)外分布狀況，現(xiàn)已開發(fā)出多種標(biāo)記物用于外泌體的示蹤，目前外泌體的標(biāo)記物主要有熒光染料、熒光蛋白、熒光素酶和無機(jī)熒光納米材料等。熒光染料是目前最常用的外泌體示蹤標(biāo)記方法，其中親脂性染料（如DiR、DiI、PKH26、PKH67 等）是使用最多的標(biāo)記方法。雖然該方法操作簡單，但限于目前的提取方法，外泌體中會有脂蛋白雜質(zhì)的存在，親脂性染料標(biāo)記外泌體的同時也會與脂蛋白結(jié)合；另外，親脂性染料標(biāo)記外泌體后，無法將未結(jié)合的親脂性染料與外泌體完全分開，使外泌體的示蹤產(chǎn)生假陽性結(jié)果[7-9]。無機(jī)熒光納米材料標(biāo)記外泌體具有高靈敏度和高時空分辨率的特點(diǎn)，但是需要特定的昂貴的儀器才能檢測，如正電子發(fā)射斷層掃描儀、全自動γ 計數(shù)儀等[10]。由于熒光染料在標(biāo)記外泌體的過程中會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，且無機(jī)熒光納米材料的檢測儀器不具有通用性，因此本研究選擇熒光蛋白進(jìn)行外泌體的示蹤。

人外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要包括70%～90%淋巴細(xì)胞、10%～30%單核細(xì)胞和1%～2%樹突細(xì)胞。膀胱癌組織微環(huán)境中存在多種免疫細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、樹突細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞等[11]。邵劍鋒等[12]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織微環(huán)境中CD163+/CD206+單核巨噬細(xì)胞異常增高，且該群細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。Chen 等[13]發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞在膀胱癌組織區(qū)域可進(jìn)行M2 極化并分化。目前，膀胱癌生物學(xué)行為與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系尚未明確，本研究初步探討了膀胱癌外泌體與PBMC 之間的聯(lián)系。

本研究通過將CD63 基因插入到pLVX-EGFPpuro 慢病毒載體中，構(gòu)建出表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，得到CD63-EGFP 慢病毒，用CD63-EGFP 慢病毒侵染膀胱癌5637 細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細(xì)胞株，提取其外泌體進(jìn)行鑒定，最后將EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體或膀胱癌細(xì)胞與人正常膀胱上皮細(xì)胞SVHUC-1 和PBMC 共培養(yǎng)，探討SV-HUC-1 和PBMC對膀胱癌外泌體的攝取情況。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素、嘌呤霉素、Ficoll 分離液和Transwell 小室（北京索萊寶科技有限公司），F(xiàn)BS（Biological Industries 公司，以色列），無外泌體FBS（SBI 公司，美國），TRIzol 裂解液（Life Technologies 公司，德國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher 公司，德國），DNA 聚合酶、EcoR Ⅰ酶、Xho Ⅰ酶、T4 DNA 連接酶（TaKaRa公司，日本），PEI 和聚凝胺（Sigma 公司，美國）。

兔抗人CD63 抗體、兔抗人HSP70 抗體和兔抗人Lamin B1 抗體（Abcam 公司，英國），山羊抗兔抗體（Proteintech 公司，美國）。pLVX-EGFP-puro、psPAX2、pMD2.G、293T 細(xì)胞系、5637 細(xì)胞系和SVHUC-1 細(xì)胞系由梅曉峰教授惠贈。PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。CD63 上游引物：CGCGAATTCATGGCGGTGGAAGGAGGAATG；下游引物：CGCCTCGAGGCATCACCTCGTAGCCACTTC。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒

體外培養(yǎng)5637 細(xì)胞，用TRIzol 裂解液提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系：5× Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAid RT（200 U/μL）1 μL，Oligo（dT）18 primer 1 μL，RNA 1 μg，加無核酸酶水至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃60 min，70 ℃5 min，1 個循環(huán)。以cDNA 為模板，PCR 反應(yīng)擴(kuò)增CD63，PCR 反應(yīng)體系：5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，CD63-F（10 μmol/L）1 μL，CD63-R（10 μmol/L）1 μL，CD63 50 ng，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，加無核酸酶水至50 μL；反應(yīng)條件：98 ℃1 min，1 個循 環(huán)，98 ℃10 s，55 ℃15 s，68 ℃1 min，30 個 循環(huán)，膠回收CD63 DNA。用EcoR Ⅰ酶和Xho Ⅰ酶酶切CD63 DNA 和質(zhì)粒pLVX-EGFP-puro，膠回收酶切片段。用DNA 連接酶將CD63 酶切片段連入質(zhì)粒pLVX-EGFP-puro 中得到pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒，連接條件：25 ℃，2 h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)菌中，轉(zhuǎn)化條件：42 ℃，90 s。通過含100 μg/mL Amp 的LB 平板篩選出陽性菌落，挑取單個菌落搖菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行Xho Ⅰ酶和EcoR Ⅰ酶雙酶切鑒定，并由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將293T 細(xì)胞按3×105個/孔的密度接種到6 孔板中，24 h 后更換為2 mL DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；取兩個EP 管，加入250 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基，一個加入4 μg 混合質(zhì)粒（pLVX-CD63-EGFP:psPAX2:pMD2.G=4:3:2），另一個加入12 μg PEI，靜置10 min；將含有PEI 的Opti-MEM 培養(yǎng)基加到含有混合質(zhì)粒的培養(yǎng)基中，靜置20 min；把質(zhì)粒-PEI 混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基上清中；8 h 后更換為2 mL DMEM 完全培養(yǎng)基；48 h 后收集上清，500×g 離心5 min，用0.45 μm過濾器過濾上清，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 慢病毒侵染膀胱癌細(xì)胞

將5637 細(xì)胞按3×105個/孔接種到6 孔板中，24 h 后更換為1 mL 含8 μg/mL 聚凝胺的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，加入1 mL 病毒上清液；24 h 后更換為2 mL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基；48 h 后，用含2 μg/mL 嘌呤霉素的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基篩選表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細(xì)胞。

1.2.4 超速離心法提取外泌體

用不含外泌體的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5637 細(xì)胞，收集上清；4 ℃，300×g 離心10 min，收集上清；4 ℃，2 000×g 離心10 min，收集上清；4 ℃，10 000×g 離心30 min，收集上清；4 ℃，100 000×g 離心70 min，棄上清；加入PBS 重懸沉淀，再次4 ℃，100 000×g 離心70 min，棄上清，收集沉淀，加入100 μL PBS 重懸，放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.5 外泌體的鑒定

1.2.5.1 透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)

將15 μL 外泌體樣本加在銅載網(wǎng)表面，靜置150 s；滴加15 μL 3%醋酸雙氧鈾溶液在銅載網(wǎng)表面，染色3 min，用濾紙吸去上層多余液體；滴加30 μL超純水在銅載網(wǎng)上洗去多余的醋酸雙氧鈾，用濾紙吸去上層多余液體；室溫干燥2 h 后拍照。

1.2.5.2 粒徑分析

用PBS 將15 μL 外泌體樣本稀釋為1 mL，震蕩混勻，緩慢注入到樣品池中，測定外泌體的粒徑大小。

1.2.5.3 Western blot 檢測外泌體的標(biāo)志蛋白

將5637 細(xì)胞在含1 mmol/L PMSF 和1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中冰上裂解30 min，裂解液4 ℃，5 000×g 離心15 min，取上清。用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將外泌體和細(xì)胞裂解液在100 ℃下煮沸10 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，PVDF 膜在BSA 封閉液中封閉2 h，與相應(yīng)的抗體4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗室溫下孵育2 h。使用以下抗體：抗CD63（1:1 000）、抗HSP70（1:1 000）、抗Lamin B1（1:1 000）、山羊抗兔IgG 抗體（1:5 000）。最后，將PVDF 膜用標(biāo)準(zhǔn)ECL 試劑處理檢測。

1.2.6 EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體與SV-HUC-1 共培養(yǎng)

把蓋玻片放入6 孔板中，將SV-HUC-1 按照2×106個/孔的密度接種到板中，培養(yǎng)8 h 后向培養(yǎng)基中加入EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄上清，PBS 清洗細(xì)胞3 次；加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，靜置20 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次；加入200 μL 0.1 μg/mL DAPI 染料，靜置5 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次；室溫避光靜置15 min 后，用共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細(xì)胞與PBMC 共培養(yǎng)

使用Ficoll 分離液從健康人的外周血中提取PBMC，按2×105個/孔的密度接種到6 孔板中，同時將表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細(xì)胞按2×105個/孔接種到0.4 μm 孔徑的Transwell 小室中，再把Transwell 小室放入6 孔板中共培養(yǎng)，將未作處理的PBMC 設(shè)為對照組，24 h 后用BD FACSCantoTM Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測PBMC。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將CD63 基因插入到pLVX-EGFP-puro，得到pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒圖譜如圖1A 所示。pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ酶和Xho Ⅰ酶酶切后，得到兩個片段，分別與CD63 基因和pLVX-EGFP-puro 質(zhì)粒的堿基數(shù)一致（圖1B）。pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果與CD63 基因序列完全匹配，無基因突變。

圖1 pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of pLVX-CD63-EGFP recombinant plasmid

2.2 表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細(xì)胞株的構(gòu)建

通過PEI 將pLVX-CD63-EGFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，獲得CD63-EGFP 慢病毒，侵染5637 細(xì)胞后，用嘌呤霉素篩選出表達(dá)CD63-EGFP融合蛋白的細(xì)胞株，在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光信號（圖2、3）。

圖2 表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細(xì)胞Fig.2 5637 cells expressing CD63-EGFP fusion protein

2.3 外泌體的鑒定

通過超速離心法提取外泌體，透射電子顯微鏡下觀察到外泌體呈杯口狀（圖3A）。粒徑分析顯示，外泌體直徑40～120 nm（圖3B）。Western blot 結(jié)果顯示，外泌體中表達(dá)有四跨膜蛋白CD63 和熱休克蛋白HSP70，不表達(dá)細(xì)胞核中特有的核纖層蛋白Lamin B1（圖3C）。

圖3 EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體的鑒定Fig.3 Identification of EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.4 SV-HUC-1 可在體外攝取膀胱癌外泌體

將EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體加入SV-HUC-1的培養(yǎng)基中，與SV-HUC-1 共培養(yǎng)后，可在SVHUC-1 中觀察到大量綠色熒光信號，分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖4）。

圖4 與EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體共培養(yǎng)后的SV-HUC-1Fig.4 SV-HUC-1 cells co-cultured with EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.5 PBMC 中的單核細(xì)胞可在體外攝取膀胱癌細(xì)胞外泌體

將表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細(xì)胞與PBMC 通過Transwell 小室共培養(yǎng)后，可在PBMC 中檢測到15.4%的單核細(xì)胞攜帶有綠色熒光信號，而對照組中沒有細(xì)胞攜帶有綠色熒光信號（圖5）。

圖5 單核細(xì)胞體外攝取膀胱癌細(xì)胞外泌體Fig.5 In vitro uptake of exosomes from bladder cancer cells by monocytes

3 討論

外泌體是細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境的囊泡，通過傳遞生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，在多種生理病理活動中發(fā)揮作用，包括免疫反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展等[14]。但由于外泌體屬于納米級囊泡，未明確外泌體的體內(nèi)外生物學(xué)功能，常需要進(jìn)行熒光標(biāo)記示蹤。本研究通過外泌體標(biāo)志蛋白CD63 與EGFP 的融合蛋白來標(biāo)記膀胱癌外泌體，避免了使用熒光染料可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，同時使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可檢測，為研究膀胱癌外泌體的體內(nèi)外分布情況奠定了基礎(chǔ)。

腫瘤微環(huán)境在癌癥的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，而膀胱癌對多種腫瘤微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞造成影響，導(dǎo)致膀胱癌的進(jìn)展。Lin 等[15]證明，膀胱癌細(xì)胞通過外泌體將miRNA-21 傳遞給巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞極化為M2 表型，促進(jìn)膀胱癌的侵襲遷移能力。Ringuette 等[16]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌能通過外泌體將轉(zhuǎn)化生長因子-β 傳遞給成纖維細(xì)胞，激活SMAD 通路，使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。本研究通過EGFP 標(biāo)記的膀胱癌外泌體與SVHUC-1 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SV-HUC-1 能在體外攝取膀胱癌外泌體，證明EGFP 標(biāo)記的外泌體可用于體外示蹤。

另外，Ying 等[17]證明了外泌體可以從Transwell小室的上室到達(dá)下室并影響下室細(xì)胞的功能。Gao等[18]通過Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了成熟樹突細(xì)胞外泌體可促進(jìn)內(nèi)皮的炎癥。因此，本研究使用Transwell 小室將表達(dá)CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細(xì)胞與PBMC 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PBMC 中的單核細(xì)胞可在體外攝取膀胱癌細(xì)胞外泌體，證明了用融合蛋白標(biāo)記外泌體的方法可以省去外泌體的提取過程，直接通過細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行外泌體的體外示蹤研究，而且可以通過流式細(xì)胞技術(shù)對細(xì)胞攝取外泌體的情況進(jìn)行分析，而膀胱癌外泌體對SVHUC-1 和單核細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響尚需進(jìn)一步研究。