活血止痛膠囊/片中5種皂苷類成分含量測(cè)定及確證非法添加方法的建立Δ

陳潔，史達(dá)，曹玉，張玲1，#（1.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京 1111；.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 11198）

活血止痛膠囊、活血止痛片均由當(dāng)歸、三七、乳香（制）、冰片、土鱉蟲、煅自然銅6味藥材組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效，主治跌打損傷、瘀血腫痛，臨床多用于治療急慢性軟組織損傷類疾病[1]?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2020年版《中國(guó)藥典》（一部）（以下簡(jiǎn)稱“藥典”）僅要求采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)活血止痛膠囊中三七藥材的質(zhì)量標(biāo)志性成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)3種成分的總含量進(jìn)行了限定[1]；而國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ25062005-2010Z并未對(duì)活血止痛片中上述標(biāo)志性成分的含量進(jìn)行限定[2]?？梢?，活血止痛膠囊/片的質(zhì)控指標(biāo)有限，其內(nèi)在質(zhì)量難以得到全面評(píng)價(jià)。

人參、西洋參、三七均為五加科人參屬植物，均以皂苷類化合物為主要活性成分，三者化學(xué)成分相近，且西洋參中人參皂苷Rb1和人參皂苷Re的含量遠(yuǎn)高于三七[3]，若以西洋參投料則較易滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)中皂苷總含量的相關(guān)規(guī)定。有報(bào)道指出，活血止痛膠囊/片等中藥復(fù)方制劑中可能存在人參、西洋參邊角料及三七莖葉非法添加的現(xiàn)象[4-7]。鑒于常規(guī)液相色譜方法靈敏度低、分離效果不佳，難以滿足復(fù)方制劑中非法添加的檢測(cè)要求，故建立統(tǒng)一的定量分析方法以同時(shí)檢測(cè)活血止痛膠囊/片中多種質(zhì)量標(biāo)志性皂苷類成分的含量并確證其非法添加現(xiàn)象，對(duì)全面控制制劑的質(zhì)量具有重要意義。為此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法同時(shí)檢測(cè)活血止痛膠囊/片中三七指標(biāo)性皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re的含量，并通過(guò)檢測(cè)人參特征性指標(biāo)成分人參皂苷Rf、三七莖葉特征性指標(biāo)成分人參皂苷Rb3、西洋參特征性指標(biāo)成分?jǐn)M人參皂苷F11來(lái)確證上述制劑的非法添加現(xiàn)象[8-12]。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACQUITY UPLC-HCLASS型超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S Micro型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司），Milli-Q型純水儀（美國(guó)Merck Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)110745-201921，純度90.4%）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)110703-202034，純度94.0%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)110704-202028，純度93.1%）、人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)110754-202129，純度96.0%）、人參皂苷Rd對(duì)照品（批號(hào)111818-202104，純度97.3%）、人參皂苷Rf對(duì)照品（批號(hào)111719-201806，供鑒別用）、人參皂苷Rb3對(duì)照品（批號(hào)111686-202005，純度96.5%）、擬人參皂苷F11對(duì)照品（批號(hào)110841-200404，純度99.5%）、三七對(duì)照藥材（批號(hào)120941-201409）、人參對(duì)照藥材（批號(hào)120917-201712）、西洋參對(duì)照藥材（批號(hào)120997-201810）、三七莖葉皂苷對(duì)照提取物（批號(hào)110871-202102）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，正丁醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

活血止痛膠囊/片均為市售產(chǎn)品，分別購(gòu)自南京中山制藥有限公司、珠海安生鳳凰制藥有限公司、江西百神昌諾藥業(yè)股份有限公司等6家企業(yè)，共計(jì)40個(gè)批次，具體來(lái)源信息見表1。

表1 活血止痛膠囊/片的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

以Agilent RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）為色譜柱，以水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，80%A→70%A；10～15 min，70%A→40%A；15～15.5 min，40%A→80%A；15.5→20 min，80%A）；流速為0.35 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為2 μL。

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓為3 500 V；脫溶劑氣為氮?dú)?，脫溶劑氣溫度?00℃。8種待測(cè)皂苷類成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 8種待測(cè)皂苷類成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液和三七莖葉提取物對(duì)照溶液 取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，制得上述8種成分質(zhì)量濃度分別為1.065、1.068、1.069、1.147、1.017、1.053、1.120、1.336 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。另取三七莖葉皂苷對(duì)照提取物適量，同法制得質(zhì)量濃度為1.216 mg/mL（以提取物質(zhì)量計(jì)）的三七莖葉提取物對(duì)照溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，混勻，制得各成分質(zhì)量濃度分別為149.95、149.95、150.08、150.02、149.91、149.95、150.08、149.90 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取活血止痛膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流2.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL至10 mL量瓶中，用20%乙腈定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。取活血止痛片樣品，研磨成粉，同法操作。

2.2.4 對(duì)照藥材溶液 取西洋參、人參、三七對(duì)照藥材各約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，照“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，制得各對(duì)照藥材溶液。

2.2.5 空白溶液 取80%甲醇適量，作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各適量，按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄總離子流圖（圖1A～圖1B，片劑和空白溶液的色譜圖略）。由圖1可知，各成分色譜峰峰形良好，空白溶液對(duì)各成分的測(cè)定無(wú)干擾。

在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[8-12]，本研究通過(guò)比對(duì)含擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf混合對(duì)照品和各對(duì)照藥材、三七莖葉提取物對(duì)照溶液的總離子流圖（圖1A和圖1C～圖1F）可知，三七中含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd；擬人參皂苷F11為西洋參特有成分，人參皂苷Rb3為三七莖葉特有成分，人參皂苷Rf為人參特有成分，三七藥材中基本不含有以上3種成分，故前述5種成分可作為三七質(zhì)量評(píng)價(jià)的考察指標(biāo)。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL，用20%乙腈逐級(jí)稀釋，制成不同質(zhì)量濃度（含8個(gè)濃度點(diǎn)）的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，各待測(cè)成分在各自的檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系（R2＞0.997），詳見表3。

表3 8種待測(cè)皂苷類成分的回歸方程、線性范圍和檢測(cè)限、定量限

2.3.3 檢出限與定量限考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用20%乙腈逐級(jí)稀釋，按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比3∶1計(jì)算檢出限，以信噪比10∶1計(jì)算定量限，結(jié)果見表3。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11質(zhì)量濃度分別為19.99、19.99、20.01、20.00、19.98、19.99、20.01、19.99 ng/mL的另一混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，上述成分峰面積的RSD分別為3.52%、4.32%、4.06%、3.47%、3.16%、4.57%、5.40%、4.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一活血止痛制劑樣品（膠囊：批號(hào)190328；片劑：批號(hào)201004），精密稱定，各平行6份，分別加入人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11對(duì)照品儲(chǔ)備液89.2、95.0、74.8 μL，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11含量的RSD分別為2.69%、2.22%、2.86%、2.89%、4.81%、1.09%、1.17%、1.83%（n＝6），片劑中上述成分含量的RSD分別為2.91%、2.17%、3.04%、2.67%、3.58%、1.24%、1.32%、1.56%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.5”項(xiàng)下同一供試品溶液（膠囊：批號(hào)190328），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb3、擬人參皂苷F11峰面積的RSD均不高于4.79%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的活血止痛膠囊（批號(hào)190328）、活血止痛片（批號(hào)201004）樣品適量，各平行6份，分別精密加入與活血止痛膠囊已知量相當(dāng)?shù)娜咴碥誖1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對(duì)照品儲(chǔ)備液28.2、93.6、117.0、14.2、21.8 μL，或者與活血止痛片已知量相當(dāng)?shù)纳鲜龈鲗?duì)照品儲(chǔ)備液24.4、88.2、105.0、12.4、28.0 μL，同時(shí)加入人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11對(duì)照品儲(chǔ)備液89.2、95.0、74.8 μL。按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11的平均加樣回收率分別為 101.71%、102.40%、100.40%、101.37%、98.72%、100.00%、98.98%、98.84%，RSD分別為4.64%、3.52%、4.30%、4.21%、3.23%、1.17%、1.09%、1.83%（n＝6）；片劑中上述成分的平均加樣回收率分別為106.47%、106.10%、100.17%、102.39%、95.18%、96.22%、99.98%、98.92%，RSD 分 別 為 4.29%、3.58%、3.86%、2.81%、4.04%、2.15%、1.29%、1.71%（n＝6）。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 取不同批次的活血止痛膠囊和活血止痛片，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中各皂苷類成分的含量并進(jìn)行人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11的確證分析。不同廠家樣品的具體檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 不同廠家活血止痛膠囊/片中8種皂苷類成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝2，μg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑與提取方式考察

本課題組前期考察了不同體積分?jǐn)?shù)（70%、80%、100%）甲醇以及水飽和正丁醇對(duì)活血止痛制劑中皂苷類成分的提取效果，同時(shí)考察了加熱回流提取和超聲提取對(duì)皂苷類成分提取率的影響，結(jié)果表明，80%甲醇加熱回流提取的效果最優(yōu)，經(jīng)提取時(shí)間（1.5、2、2.5、3 h）優(yōu)化后，最終確定選用80%甲醇加熱回流提取2.5 h。

3.2 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

本課題組前期對(duì)水-甲醇、水-乙腈等流動(dòng)相的組成進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，水-乙腈流動(dòng)相體系的分離效果優(yōu)于水-甲醇體系；同時(shí)，在水相中加入0.1%甲酸可提高各待測(cè)成分的色譜響應(yīng)值，改善其色譜峰峰形，提高離子化效率。本課題組前期對(duì)不同皂苷類成分對(duì)照品溶液進(jìn)行了質(zhì)譜分析，在調(diào)節(jié)錐孔電壓和碰撞能量的同時(shí)優(yōu)化了待測(cè)成分的定量離子對(duì)，結(jié)果表明，在MRM、ESI負(fù)離子掃描模式下，各待測(cè)成分的分子離子峰均較穩(wěn)定且響應(yīng)較強(qiáng)。

3.3 檢測(cè)方法的選擇

HPLC法雖在皂苷類成分的檢測(cè)中運(yùn)用廣泛[13]，但該類成分的紫外響應(yīng)較弱，且擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb3等分子內(nèi)并無(wú)共軛體系，僅在紫外檢測(cè)器中呈末端吸收；而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器存在靈敏度低、專屬性有限的不足[14]。由此可見，將常規(guī)HPLC法作為非法添加指標(biāo)性成分的篩查手段，存在檢測(cè)靈敏度和選擇性不高的缺點(diǎn)。UPLC-MS/MS法具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性強(qiáng)、假陽(yáng)性少等優(yōu)點(diǎn)[15]，故本研究選擇該法快速檢測(cè)活血止痛膠囊/片中的皂苷類指標(biāo)性成分。

3.4 含量檢測(cè)結(jié)果分析

本研究從各批次活血止痛膠囊/片中均檢出人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、三七皂苷R1，其中膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1總含量均符合藥典的含量限度要求[1]。有研究表明，西洋參、人參、三七共有峰峰面積比值存在一定關(guān)系：在西洋參、人參、三七中，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re比值分別為0.13±0.08、1.20±0.60、8.30±3.00[16]。本課題組根據(jù)皂苷峰面積比值關(guān)系并結(jié)合特征性指標(biāo)成分對(duì)活血止痛制劑中的三七藥材質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)分析，結(jié)果顯示，制劑中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的峰面積比值為7.79～8.62，與文獻(xiàn)[16]基本一致。各批產(chǎn)品中均未檢出人參皂苷Rf、擬人參皂苷F11，部分樣品檢出了人參皂苷Rb3，經(jīng)與三七對(duì)照藥材溶液（未經(jīng)稀釋）及人參皂苷Rb3對(duì)照品溶液色譜圖對(duì)比，初步判斷人參皂苷Rb3可能與三七藥材有關(guān)；所測(cè)批次樣本中均未發(fā)現(xiàn)西洋參、人參非法添加現(xiàn)象。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，按照片劑規(guī)格及日服用量等量折算，江西桔王藥業(yè)有限公司的活血止痛片中5種皂苷類成分的含量普遍低于其他生產(chǎn)廠家樣品，考慮可能存在三七投料量偏低的現(xiàn)象。

綜上所述，本文以UPLC-MS/MS法為手段，建立了同時(shí)測(cè)定活血止痛膠囊/片中5種指標(biāo)性皂苷類成分含量和確證西洋參、人參、三七莖葉非法添加的檢測(cè)方法，可為活血止痛制劑的質(zhì)量控制提供參考，為打擊非法添加行為提供技術(shù)支撐。