寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮提取方法的優(yōu)化及含量比較

李福森，張 勇，宋吉玲，高 偉，王戰(zhàn)偉，王雨亞，陳麗娜

(1.長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130032；2.遵義市紅花崗區(qū)南關(guān)中學(xué)，貴州 遵義 563000)

蒲公英是菊科、蒲公英屬Taraxacum草本植物，可食藥兩用，且資源豐富。植株包括根、莖、葉、花和種子[1-2]。據(jù)報道，蒲公英屬植物遍及世界各地，數(shù)量約2 000多種，我國有70種左右[3]。蒲公英性寒，味苦、甘，對疔瘡腫毒、乳癰、目赤、咽痛、肺癰等癥的治療效果較好[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗炎、抗癌、抗高血糖、消腫散結(jié)等功效[5-8]。蒲公英中含有多種化學(xué)成分，主要包括黃酮類、甙類、萜類、酚類、膽堿等[9]。在其全草中，黃酮類化合物含量豐富，黃酮類具有較好的抗氧化、抑菌、延緩衰老和提高免疫力等作用[10]。

對中草藥中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，提取過程較為關(guān)鍵，相對于回流、煎煮法等傳統(tǒng)提取方法，更高效便捷的超聲、微波提取等應(yīng)用也愈加廣泛[11]。其中，超聲提取利用空化、振動攪拌、高速粉碎等作用，使組織破壁、分解，達(dá)到細(xì)胞中有效成分迅速溶于溶劑的目的[12-13]，在中藥有效成分提取中應(yīng)用較多[14]。

黃酮類化合物作為蒲公英中含量較高的成分，對其進(jìn)行深入研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[15]。目前，關(guān)于蒲公英中不同部位的總黃酮提取的研究相對較少。本文以蒲公英的葉、生根和熟根為研究對象，通過回流法及超聲法提取蒲公英中有效成分，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取的最佳條件，為蒲公英中黃酮類成分的開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

蒲公英生根、熟根和葉來源于吉林省延邊州安圖縣新合恒源蒲公英生產(chǎn)專業(yè)合作社(7月份采摘)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司，純度大于99%；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑，購自北京精細(xì)化學(xué)品有限公司。

FA1204A電子分析天平(德國賽多利斯公司)；DU800紫外分光光度計(jì)(美國 Beckman 公司)；KH-250DB 數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；ZUOT-SYG4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)；FW-100高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

精密稱取蒲公英樣品粉末(葉、生根或熟根)約1 g(準(zhǔn)確至0.001 g)，加入適量乙醇溶液，進(jìn)行超聲或回流提取，過濾，濾液減壓回收， 95%的乙醇定容至 10 mL，得到不同的蒲公英總黃酮提取物，放入 4℃冰箱保存，待測。

2.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定蒲公英中總黃酮含量，分別移取0.5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0，0.02，0.04，0.06，0.08 和 0.10 mL 于 6支離心管中，依次加入 5% NaNO260 μL、無水乙醇400 μL，混勻后放置 5 min。繼續(xù)加入60 μL 10% 的Al(NO3)3，混勻，放置 5 min。加入 1 mol/L NaOH，混勻，放置10 min。在波長510 nm下測吸光度A，平行3次。以蘆丁的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)， 吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮含量為提取物中總黃酮在粗提物中的質(zhì)量百分比。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)

參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、占空比、超聲功率和超聲時間5個考察因素，每個因素選取4個水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平編碼如表1所示。采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的實(shí)驗(yàn)條件。

表1 超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼表

2.3.2 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)

參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時間、回流次數(shù)和回流溫度5個考察因素，在每個因素選取4個水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平編碼如表2所示。采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化回流法提取寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的實(shí)驗(yàn)條件。

表2 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=2.818 9x+0.212 9，回歸系數(shù)r為0.998 1。在0.024～0.071 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

3.2 優(yōu)化超聲法提取蒲公英中總黃酮條件

分別采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮提取的條件，以蒲公英熟根的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行說明和分析。直觀分析法見表3，比較5個因素的R值，表明料液比是最主要影響因素，其他因素的影響程度依次為占空比、超聲時間、超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)，蒲公英熟根中總黃酮提取的最優(yōu)方案是A2B2C4D4E3，既料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、占空比為 100%、超聲功率為100 W、超聲時間為40 min。方差分析結(jié)果表明(表4)，去掉最大誤差項(xiàng)B后做方差分析，在其余4個因素中，只有A的P值小于0.05，其影響達(dá)顯著水平。根據(jù)F值可知，影響蒲公英熟根中總黃酮得率因素的主次順序?yàn)锳、C、E、D，與直觀分析結(jié)果一致。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表4 方差分析結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蒲公英葉中的總黃酮提取最優(yōu)方案是A2B1C3D4E1，既料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、占空比為80%、超聲功率為100 W、超聲時間為25 min，有利于蒲公英葉中總黃酮的提取。蒲公英生根中的黃酮提取的最優(yōu)方案是A1B3C1D1E1，既料液比為1∶10 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、占空比為40%、超聲功率為40 W、超聲時間為25 min。

3.3 優(yōu)化回流法提取蒲公英中總黃酮條件

采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化回流法對蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的提取條件，以蒲公英葉中總黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行說明和分析。根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，通過直觀分析比較5個因素的極差R值，發(fā)現(xiàn)料液比是影響蒲公英葉中總黃酮提取效果的最重要因素，其他因素的影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流溫度、回流時間和回流次數(shù)。通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取方案是A4B4G1H2I4，既在料液比為1∶40 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、時間為30 min、提取為2 次、回流溫度為90℃時，有利于蒲公英葉中總黃酮得率提高。通過方差分析(表6)可知，去掉最大誤差項(xiàng)H(回流次數(shù))，其余4種因素中只有A(料液比)的P值小于0.01，說明其影響極顯著。從各因素的F值可得出，影響蒲公英葉中總黃酮得率因素的主次順序?yàn)锳、B、I、G，與直觀分析結(jié)果一致。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表6 方差分析結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蒲公英生根中的總黃酮提取的最優(yōu)方案A4B2G3H2I4，即在料液比1∶40 g/mL、回流時間60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、回流溫度90℃，提取2 次，有利于蒲公英生根中總黃酮的提取。而蒲公英熟根中總黃酮提取的最佳方案為A2B3G3H4I1，在料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、回流溫度為60℃、提取4次，每次回流60 min，在熟根中所提取的總黃酮含量較高。

3.4 超聲和回流提取方法對蒲公英不同提取物中總黃酮含量影響

根據(jù)上述優(yōu)化后的提取條件，分別采用超聲提取法和回流提取法對蒲公英生葉、生根和熟根中總黃酮進(jìn)行提取，平行3次，結(jié)果如表7所示。

表7 不同提取方法對蒲公英中總黃酮含量影響

結(jié)果表明，回流法更有利于蒲公英葉中總黃酮提取，而超聲法提取蒲公英生根和熟根中總黃酮含量更高。導(dǎo)致這種情況的原因可能由于葉與根的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，提高溫度更有利于葉中黃酮類化合物的提取，而超聲提取能夠增強(qiáng)溶劑對于根細(xì)胞的穿透力，通過對物料細(xì)微局部進(jìn)行撞擊，促使植物組織破壁、分解，從而使細(xì)胞中的化學(xué)成分能夠迅速進(jìn)入溶劑相中，因此，超聲提取的蒲公英生根和熟根中總黃酮含量遠(yuǎn)高于回流提取物。結(jié)果表明，超聲法提取蒲公英中黃酮類化合物是一種迅速、高效的方法，更有利于蒲公英中黃酮資源的工業(yè)生產(chǎn)以及合理利用。

通過對比蒲公英葉、生根中總黃酮含量發(fā)現(xiàn)，生根中的總黃酮含量與葉差距較大。特別是超聲提取物，生根中的總黃酮含量是蒲公英葉中含量的三倍。而生根回流提取物中的總黃酮含量相對于超聲提取物有所減少，但仍高于葉，兩者含量相差較小。對比蒲公英的熟根和生根提取物中總黃酮含量發(fā)現(xiàn)，生根中的總黃酮含量略高于熟根，原因可能是在生根炒制的過程中，由于溫度較高，造成了黃酮類化合物的損失。

4 結(jié)語

本文以蒲公英提取物中總黃酮含量為指標(biāo)，分別優(yōu)化超聲、回流提取長白山寒地蒲公英葉、生根和熟根實(shí)驗(yàn)條件，根據(jù)優(yōu)化后的條件分別對不同的蒲公英部位進(jìn)行提取，比較不同提取方法以及不同部位提取物中總黃酮含量的差異。結(jié)果表明，蒲公英生根中總黃酮含量最高，其次是熟根，葉中總黃酮含量相對最低；相對于回流提取，超聲提取更有利于蒲公英中總黃酮提取率的提高，特別是對于蒲公英生根和熟根中總黃酮的提取效果較好，且超聲提取具有省時高效、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。本研究為蒲公英的深加工和綜合利用提供了探索及參考。